改進pH示差法檢測不同植物源性食品中花青素的方法

譚亮，李玉林，杲秀珍，趙靜，王婷，蔣桂娟，王虹蕾，王環

(中國科學院西北高原生物研究所 青海省青藏高原特色生物資源研究重點實驗室，青海 西寧，810001)

花青素屬于酚類化合物中的類黃酮[1]，是自然界中一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，構成了植物中絕大多數的藍色、紅色、紫色和黃色等。花青素來源豐富，如葡萄、黑加侖、覆盆子、草莓、櫻桃、紅甘藍、紫皮茄等[2]。據統計，有27個科73個屬的植物中含花青素[3]。在植物中花青素多與糖以糖苷鍵結合形成花色苷，并與芳香酸、脂肪酸等進行酰基化作用以增加其穩定性[4]。隨著各國對合成色素使用的限制，作為天然食用色素的花青素，其資源豐富，安全、無毒，且具有清除體內自由基、抗腫瘤、抗癌、抗輻射、抑制脂質過氧化和血小板凝集、預防糖尿病、減肥、保護視力等營養和藥理作用[5-7]，在食品工業中的應用備受關注。

目前，花青素的檢測方法主要有液質聯用法、高效液相色譜法、單一pH法、pH示差法等[8-13]。單一pH法和pH示差法均采用分光光度計測定總花青素含量，實驗步驟簡單、方法穩定易操作、成本低，總花青花的含量測定多采用此法[14]。在緩沖溶液中，花青素的結構隨pH值改變而轉變，其發色團的結構轉換是pH的函數，而干擾物質(如褐色降解物)的特征光譜不隨pH值的改變而發生變化，花青素不會受到體系中其他干擾物質的影響，pH示差法即基于此原理。但采用pH示差法檢測花青素時均以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷計，對于除含有矢車菊素-3-O-葡萄糖苷以外還含有其他花青素，或者完全不含有矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的植物源性食品而言，這樣的數據處理必然造成很大誤差。

本文以23種含花青素的植物源性食品為研究對象，通過液相色譜-三重四級桿串聯質譜法(liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)鑒別出不同植物源性食品中花青素種類和具體化學結構，并計算出混合花青素的平均摩爾質量，通過分光光度法測得混合花青素的平均摩爾消光系數，以此對pH示差法進行改進。并對pH示差法改進前后的檢測結果進行差異比較分析，以期為花青素做為天然食用色素進行質量控制，并對開發利用花青素提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

黑果枸杞、黑豆、黑米、黑葡萄干等4種植物源性食品干樣品各3批，市售。用四分法取適量或全部，去除枝、稈、葉、皮、小石子、土顆粒等肉眼可見雜質后，取有代表性試樣50～100 g。黑果枸杞、黑豆、黑米用食物粉碎機粉碎后，過40目篩，混勻后立即用于檢測，暫存時間不超過1 h，置于干燥器中避光保存；黑葡萄干需先剪碎成直徑為3～5 mm小顆粒，然后用食物粉碎機粉碎，混勻后，置4 ℃冰箱冷藏避光保存，1 h內檢測。

紫皮茄子、紫薯、紫洋蔥、紫甘藍、紫白菜、大櫻桃、紫葡萄、提子、藍莓、黑樹莓、心里美蘿卜、紫土豆、紫蘇葉、黑玉米、櫻桃番茄、車厘子、桑葚、草莓、魚腥草葉等19種植物源性食品鮮樣各3批，市售。用自來水初步洗凈，去離子水淋洗后用濾紙吸去多余的水分。其中，紫皮茄子只取茄皮，大櫻桃、紫葡萄、提子、車厘子去核。各試樣用勻漿分散機15 000 r/min勻漿30 s，置于4 ℃冰箱冷藏避光保存，1 h內檢測。整個處理過程避光進行。不能在1 h內進行實驗的試樣需置-18 ℃冰箱冷凍保存。

飛燕草素、矢車菊素、矮牽牛素、天竺葵素、芍藥色素和錦葵色素的3位取代單葡萄糖苷標準品(純度均≥97%)，上海惠誠生物科技有限公司；氯化飛燕草素-3-O-[6″-O-(E)-對香豆酰蕓香糖苷]-5-O-葡萄糖苷(純度≥98%)，寶雞市辰光生物科技有限公司；氯化矢車菊素-3-O-(6-O-反式-咖啡酰-2-O-β-葡萄糖苷-β-葡萄糖苷)-5-O-β-葡萄糖苷、氯化矮牽牛素-3-O-蕓香糖苷(反-對香豆酰)-5-O-葡萄糖苷、氯化天竺葵素-3-O-[6″-O-(E)咖啡酰槐糖苷]-5-O-葡萄糖苷、氯化芍藥色素-3-O-槐糖苷-5-O-β-D-葡萄糖苷(純度均≥98%)，武漢科斯坦生物科技有限公司；氯化矮牽牛素-3,5-二氧葡萄糖苷(純度≥95%)，成都瑞芬思德丹生物科技有限公司。

KCl、結晶乙酸鈉、無水乙醇(均為分析純)，天津百世化工有限公司；濃鹽酸(分析純)，甘肅白銀瑞斯物資貿易有限公司；甲酸、乙腈(均為色譜純)，山東禹王實業有限公司化工分公司；實驗用水為去離子水。

1260 Infinity Ⅱ- 6470 液相色譜-三重四級桿串聯質譜儀，美國安捷倫科技公司；UV-1780紫外-可見分光光度儀，日本島津公司；KQ5200B超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；T25數顯型分散機，艾卡(廣州)儀器設備有限公司；pHS-3E型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；PL203電子天平、MS205DU精密電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；TGL-16C高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；TYSP-100高速多功能粉碎機，浙江永康市紅太陽機電有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 LC-MS/MS法鑒別花青素

采用LC-MS/MS法，根據紫外-可見最大吸收波長、水解前后母離子峰(M-/M+)和子離子峰碎片(MS/MS)的質荷比值(m/z)并結合文獻[15～26]，鑒別出連有糖苷鍵的各花青素具體化學結構。

1.2.1.1 液相色譜條件

Agilent Eclipse Plus C18 Rapid Resolution HD柱(50 mm× 2.1 mm，1.8 μm)，流動相：A，質量分數1%的甲酸乙腈溶液；B，質量分數1%的甲酸水溶液(0～15 min，5% A～20% A；15～20 min，維持20% A不變；20～30 min，20% A～60% A；30～35 min，維持60% A不變；35～40 min，60% A～5% A；40～58 min，維持5% A不變)。流速0.20 mL/min，檢測波長530 nm，柱溫35 ℃，進樣量1 μL。

1.2.1.2 質譜條件

電噴霧電離源，正、負離子方式檢測；離子源溫度450 ℃，碰撞氣N2，流量0.2 mL/min；霧化氣N2，噴霧壓力20 psi；干燥氣N2，溫度325 ℃，流量10.0 L/min；鞘氣N2，溫度400 ℃，流量11.0 L/min；質荷比掃描范圍m/z100～1 500；毛細管電壓4 kV(正離子)、2 500 V(負離子)；掃描方式為MS2。

1.2.2 混合花青素平均摩爾質量的確定

采用LC-MS/MS法，根據非水解試樣中各花青素在總花青素中物質的量分數(Nx%)和各自摩爾質量(Mx)，各試樣中混合花青素的平均摩爾質量(M混)按照公式(1)計算：

M混=Ma×Na%+Mb×Nb%+Mc×Nc%+…Mn×Nn%

(1)

1.2.3 分光光度法確定混合花青素平均摩爾消光系數

(2)

式中：c, 花青素檢測溶液濃度，mol/L；l，比色皿厚度，cm。

1.2.4 pH示差法檢測花青素含量

參照美國分析化學家協會 (Association of Official Analytical Chemists，AOAC)官方方法2005.02《果汁、飲料、天然著色劑及酒中總花色苷含量的測定pH示差法》，并稍作修改。稱取已制備好的鮮樣勻漿5.0 g或者干樣粉末0.5 g，按料液比鮮樣1∶10(g∶mL)或干樣1∶100(g∶mL)加入50 mL濃鹽酸-80%乙醇提取溶液(3∶97，體積比)于50 ℃下超聲波提取30 min，每隔10 min振搖1次，保持固相完全分散。以8 000 r/min離心3 min，取上清液，即得花青素提取母液。其中，藍莓、黑米、黑果枸杞、桑葚的花青素提取母液分別加入原提取溶液分別稀釋2、2、4、5倍，其余各花青素提取母液無需用原提取溶液稀釋。然后再用緩沖溶液稀釋5倍，制備2份供試品檢測溶液，其中一份用KCl緩沖溶液(0.025 mol/L, pH 1.0)稀釋，另一份用乙酸鈉緩沖溶液(0.4 mol/L, pH 4.5)稀釋。靜置10 min后，在400～600 nm進行部分可見波段掃描以確定最大吸收波長。最后分別在最大吸收波長和700 nm處分別測定用pH 1.0緩沖溶液稀釋的供試品檢測溶液，并用pH 4.5緩沖溶液稀釋的供試品檢測溶液的吸光度值。總花青素質量分數按公式(3)計算：

(3)

1.3 數據統計分析

檢測結果以同一植物源性食品的3批次試樣中花青素質量分數的平均值±標準誤差表示，并采用SPSS 19.0配對樣本T檢驗對pH示差法改進前后的檢測結果進行差異比較分析，差異顯著性水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 不同植物源性食品中花青素的種類和化學結構

由表1可知，花青素的最大吸收波長主要有2個：一個在可見光區500～540 nm附近，另一個在紫外光區275 nm附近，如果花青素進一步酰基化則在320～340 nm處有一吸收峰。飛燕草素、矢車菊素、矮牽牛素、天竺葵素、芍藥色素、錦葵色素的特征子離子峰碎片m/z依次為303、287、317、271、301、331，且正、負2種離子模式下同一成分的母離子峰、子離子峰碎片m/z均相差2。不同植物源性食品中的花青素均連有糖苷鍵，多出現在3、5位，以3位居多；3位糖苷鍵連接的糖中多以葡萄糖為主，少部分連有蕓香糖和槐二糖，而5位糖苷鍵只連接葡萄糖；為了進一步增加花青素的穩定性，部分花青素在連有糖苷鍵的基礎上繼續酰基化，包括酰化作用的芳香酸如p-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸、對羥基苯甲酸等，脂肪酸如丙二酸、乙酸、蘋果酸、琥珀酸等[4]。

按含有花青素數量分析，藍莓和黑玉米中花青素數量最多，紫土豆、黑葡萄干和黑果枸杞次之，紫皮茄子、紫洋蔥和魚腥草葉中花青素數量最少，均只含有1個花青素。按含有花青素種類分析，提子和藍莓中花青素的種類最多，紫土豆、黑葡萄干和黑果枸杞次之，紫皮茄子、紫洋蔥、紫白菜和魚腥草葉中花青素的種類較少，均只含有1種花青素。鑒別出的矢車菊素、芍藥色素、錦葵色素、矮牽牛素、飛燕草素、天竺葵素在23種植物源性食品中所有花青素的分布占比依次為33.3%、24.6%、14.0%、12.3%、8.8%、7.0%，6種花青素中57.9%的花青素為矢車菊素和芍藥色素。在23種植物源性食品中，矢車菊素存在于66.7%的蔬菜、90.0%的水果中，芍藥色素存在于33.3%的蔬菜、70.0%的水果中。此外，薯類(如紫薯)、糧食作物(如黑玉米)、豆類(如黑豆)、谷類(如黑米)中均含有矢車菊素和芍藥色素。

2.2 不同植物源性食品中混合花青素的平均摩爾質量和平均摩爾消光系數

由表2可知，多數情況下，混合花青素中某一花青素物質的量分數在總花青素中占比>60%時，混合花青素的平均摩爾質量更接近于該單一花青素的摩爾質量，混合花青素中某一花青素物質的量分數在總花青素中占比>50%時，混合花青素的平均摩爾消光系數更接近于該單一花青素的摩爾消光系數。

表1 23種植物源性食品中花青素的化學結構鑒別結果Table 1 The chemical structure identification results of anthocyanidins in twenty-three kinds of plant origin foods

續表1

表2 各試樣中花青素平均摩爾質量和平均摩爾消光系數Table 2 Average molar mass and average molar extinction coefficient of anthocyanidins in each sample

續表2

續表2

不同植物源性食品的混合花青素的平均摩爾質量在449.2～784.8 g/mol，混合花青素的平均摩爾消光系數在17 807～37 150 L/(mol·cm)，若均以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷[摩爾質量為449.2 g/mol、摩爾消光系數為26 900 L/(mol·cm)]計算總花青素質量分數結果必然不準確。

2.3 pH示差法改進前后檢測結果的差異比較

在花青素最佳提取條件下，采用SPSS 19.0配對樣本T檢驗對pH示差法改進前后分別以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和以各試樣中實際含有的花青素計算總花青素質量分數的差異，比較結果見表3。改進前pH示差法檢測結果均低于改進后pH示差法，且60.9%的試樣在pH示差法改進前后其花青素的質量分數存在顯著性差異(P<0.05)。由于pH示差法在改進前均以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷計，在數據處理時也采用矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的摩爾質量和摩爾消光系數進行計算。

對于僅含有矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的植物源性食品(如紫洋蔥)，或者含有總花青素物質的量分數的80%以上矢車菊素-3-O-葡萄糖苷同時還含有少量其他花青素的植物源性食品(如大櫻桃、黑樹莓、黑豆、黑米)中花青素檢測，以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷計時，pH示差法改進前后花青素的質量分數無顯著性差異(P>0.05)，改進后檢測結果比改進前平均僅高了1.04倍。對于矢車菊素-3-O-葡萄糖苷在總花青素物質的量分數的80%以下，同時還含有較多其他花青素的植物源性食品(除紫葡萄和黑玉米外)如紫甘藍、提子、藍莓、心里美蘿卜、桑葚、草莓、黑葡萄干中花青素檢測時，若仍以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷計，pH示差法改進前后花青素的質量分數存在顯著性差異(P<0.05)，改進后檢測結果比改進前平均高了1.47倍。對于完全不含有矢車菊素-3-O-葡萄糖苷而僅含有其他花青素的植物源性食品(除紫皮茄子和紫蘇葉外)如紫薯、紫白菜、紫土豆、櫻桃番茄、車厘子、魚腥草葉、黑果枸杞中花青素檢測以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷計時，pH示差法改進前后花青素的質量分數存在顯著性差異(P<0.05)，改進后檢測結果比改進前平均高了1.65倍。

表3 pH示差法改進前后花青素檢測結果的差異 單位：mg/100 g

綜上所述，對于除含有矢車菊素-3-O-葡萄糖苷以外還含有其他花青素，或者完全不含有矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的植物源性食品而言，以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷計算總花青素質量分數必然造成很大誤差。

3 討論

3.1 LC-MS/MS法鑒別花青素的結果分析

食品中的天然色素有很多種，按其化學結構分為多烯色素、多酚色素、醌酮色素、吡咯色素等。花青素只是食品中天然色素的一類，屬于多酚色素，其基本結構母核是2-苯基苯并吡喃。自然界天然存在的花青素有250多種，其中已確定結構的花青素有22種[27]，大多數花青素其C環3位、A環5、7位、B環3′、4′、5′位等均有取代。飛燕草素各取代位羥基化程度最高，矢車菊素各取代位羥基化程度低于飛燕草素，天竺葵素各取代位羥基化程度又低于矢車菊素，矮牽牛素、芍藥色素和錦葵色素各取代位存在羥基化的同時還存在甲基化。但因各花青素極性較相近，僅使用常規的高效液相色譜法很難去除其它色素的干擾，往往保留時間相同，不能使其他色素和目標花青素完全分離。本文通過LC-MS/MS法，使用電噴霧電離源，利用觸發式多反應監測將多反應監測定量分析與花青素離子譜圖相結合，根據花青素定量、定性離子對m/z[飛燕草素(303/229、303/257)、矢車菊素(287/137、287/213)、矮牽牛素(317/203、317/245)、天竺葵素(271/121、271/93)、芍藥色素(301/286、301/258)和錦葵色素(331/315、331/287)]，最終鑒別出6種食品中常見的花青素，但是否還存在少量其他化學結構的花青素，如7-O-甲基花青素、3-脫氧花青素、焦花青素、6-羥基花青素等，還有待于進一步鑒別分析。

3.2 pH示差法改進后的方法學驗證結果

以花青素質量分數最高的黑果枸杞為例進行方法學驗證實驗，結果顯示黑果枸杞在(530±2) nm處有最大吸收峰，而顯色后空白對照溶液在(530±2) nm處無吸收，說明不存在空白干擾，實驗方法的專屬性良好。通過LC-MS/MS法鑒別出黑果枸杞中的花青素主要為矮牽牛素類花青素，以矮牽牛素-3-O-蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷和矮牽牛素-3,5-二氧葡萄糖苷(二者物質的量分數總和占總花青素的94.13%)按各自在總花青素中物質的量分數比例(12.6∶1)配制成混合矮牽牛素類花青素標準溶液。以吸光度值為縱坐標，混合矮牽牛素類花青素質量為橫坐標，繪制標準曲線。結果顯示混合矮牽牛素類花青素質量在0.011～0.138 mg呈良好的線性關系，回歸方程為y=6.166 1x+0.011 2，R2=0.999 1。精密度、穩定性、重復性[即相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)]依次為0.53%、1.11%(24 h內)、1.68%，平均回收率為95.6%(RSD=1.06%)。黑果枸杞鮮果的檢出限和定量限分別為7.04、21.3 mg/100 g，黑果枸杞干果的檢出限和定量限分別為28.2、85.3 mg/100 g。方法學驗證實驗結果表明，該方法的專屬性、線性、精密度、穩定性、重復性、回收率、定量限和檢出限均滿足方法學驗證要求，該方法可操作性強、穩定、準確、可靠。

3.3 pH示差法改進后檢測花青素的結果分析

采用LC-MS/MS法確定各種植物源性食品中實際含有的花青素后，實驗時只需在最佳提取條件下提取，保證在pH 1.0時使花青素形成穩定的花烊正離子并加緩沖溶液稀釋、靜置、比色，最后直接利用已確定的不同植物源性食品中特有混合花青素的平均摩爾質量和平均摩爾消光系數，即可求得總花青素。但同時，鑒別出的花青素不僅連有糖苷鍵，且還與芳香酸、脂肪酸等進行酰基化作用，產生如芥子酰、阿魏酰、對香豆酰、蘋果酰、咖啡酰等酰化的花青素，而市售花青素標準品多為連有糖苷鍵的花青素，酰化的花青素標準品十分少見，只能用非酰化的花青素標準品盡可能模擬實際鑒別出的酰化花青素來確定平均摩爾質量和平均摩爾消光系數。以黑果枸杞為例，以非酰化花青素矮牽牛素-3-O-蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷、飛燕草色素-3-O-蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷和矮牽牛素-3,5-二氧葡萄糖苷計，其平均摩爾質量和平均摩爾消光系數分別為779.3 g/mol和23 346 L/(mol·cm)，計算得總花青素質量分數為2 719.96 mg/100 g；而以酰化花青素矮牽牛素-3-O-蕓香糖苷(反-對香豆酰)-5-O-葡萄糖苷、飛燕草色素-3-O-[6″-O-(E)-對香豆酰蕓香糖苷]-5-O-葡萄糖苷和矮牽牛素-3,5-二氧葡萄糖苷(不變)計，其平均摩爾質量和平均摩爾消光系數分別為912.7 g/mol和29 591 L/(mol·cm)，計算得總花青素質量分數為2 513.27 mg/100 g，2種方式結果之間精密度(相對相差)為7.90%，低于10%。雖滿足國標中食品營養成分的一般精密度要求，但同樣存在誤差，有待于進一步研究。采用高速逆流色譜、制備液相等制備出酰化的花青素純品，更真實地模擬出不同植物源性食品中實際的花青素存在方式，可得到更準確的平均摩爾質量和平均摩爾消光系數值。

3.4 pH示差法檢測花青素的適用性分析

前期研究表明，花青素在前處理提取時，選用80%乙醇超聲波提取時花青素質量分數最高，為防止提取過程中非酰基化不穩定的花青素降解，在提取溶劑中加入一定濃度的HCl溶液[V(濃鹽酸)∶V(80%乙醇)=3∶97]，并以料液比、超聲波溫度和超聲波時間3個因素作為考察對象，設計了3因素3水平正交試驗。結果花青素最佳提取條件為料液比1∶100(干樣)、1∶10(鮮樣)，超聲波溫度50 ℃，時間30 min。

溶液pH不同，花青素的存在形式也不同。在pH≤3時，其溶液呈現穩定的紅色(花烊正離子)，隨著pH值增大，在pH 4～6時，其溶液的顏色逐漸褪至無色(甲醇假堿和查爾酮)，在pH 8～10時變成紫色或藍色[醌式(脫水)堿]。根據花青素發色團的結構轉換是pH的函數，起干擾作用的褐色降解物的特性不隨pH變化，制備2份供試品檢測溶液，其中1份用pH 1.0的KCl緩沖溶液稀釋，另1份用pH 4.5的乙酸鈉緩沖溶液稀釋，保證花青素在pH 1.0緩沖溶液中形成穩定的紅色花烊正離子，此時花青素溶液吸光度值最大，同時又在pH 4.5緩沖溶液中形成無色的甲醇假堿和查爾酮，此時花青素溶液吸光度值最小。根據朗伯-比耳定律，在2個不同的pH下，花青素溶液的吸光度差值與花青素的含量成正比。通過2個pH，同一波長(花青素最大可見吸收波長)下的吸光度差值，以及在700 nm處測得的用于校正略微渾濁供試液的吸光度值，可求得花青素含量。高效液相色譜法檢測花青素時存在的色譜柱平衡費時、易污染，受外界條件影響標準品的穩定性等問題。而超聲波提取法節約時間、耗能少、提取率高、能有效保護花青素活性、操作簡單、檢測過程污染少，優勢明顯。

對于本文未涉及到的其他植物源性食品，在上述最佳提取條件下提取花青素，保證在pH 1.0緩沖溶液中使花青素形成穩定的花烊正離子并加緩沖溶液稀釋、靜置、比色，然后采用LC-MS/MS分析確定其中實際含有的花青素，以計算出混合花青素的平均摩爾質量。最后采用分光光度法，用實際含有的花青素配制成濃度為1 mol/L的混合花青素標準溶液，以確定混合花青素的平均摩爾消光系數，即可求得總花青素。該法適用于水果、蔬菜、谷物、薯類、糧食作物、豆類等植物源性食品中花青素的檢測，但需要強調的是對于脂肪含量高的含花青素食品、制品等，需在提取前加入正己烷、石油醚、乙醚等有機溶劑萃取除脂，通過破壞植物蠟質層、各類油脂以及葉綠素、胡蘿卜素等脂溶性色素，從而有利于提取溶劑滲透和花青素類成分的溶出，以減少對檢測的干擾。

4 結論

當不同植物源性食品中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷低于所含總花青素物質的量分數的80%，或者完全不含有矢車菊素-3-O-葡萄糖苷時，以實際含有的混合花青素的平均摩爾質量和平均摩爾消光系數計算總花青素的質量分數結果更準確，實驗時直接利用已確定的不同植物源性食品中特有混合花青素的平均摩爾質量和平均摩爾消光系數即可求得總花青素，簡單、快捷、易操作，可為花青素的質量控制、開發利用與加工提供數據支持。