多重實(shí)時(shí)熒光串聯(lián)PCR技術(shù)高通量檢測(cè)生蠔中9種致病菌

麻春陽(yáng)，高世玨，蔣麗婷，楊礎(chǔ)華，TANUSHREE B GUPTA，NIMA AZARAKHSH，吳希陽(yáng)*

1(暨南大學(xué) 食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州，510632)2(廣州市微生物研究所有限公司，廣東 廣州，510663) 3(梅西大學(xué)Hopkirk研究所，新西蘭 北帕默斯頓，4474)

食源性致病菌是影響食品安全最主要的因素之一。大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、單增李斯特菌和創(chuàng)傷弧菌都是即食食品中廣受關(guān)注的食源性致病菌，常引起急性胃腸炎，并伴有惡心、頭痛、低熱，嚴(yán)重時(shí)可造成死亡[1-2]。由于這9種致病菌可同時(shí)長(zhǎng)期存活于水體環(huán)境中，增加貝類產(chǎn)品在養(yǎng)殖過程中致病菌污染的可能性，進(jìn)而在人群食用過程中產(chǎn)生食物中毒[3]。因此建立一種可靠的、針對(duì)這9種致病菌檢測(cè)的快速方法，對(duì)于食品安全、健康和民生都有重要意義。

目前已有關(guān)于貝類產(chǎn)品中食源性病毒(如諾如病毒)快速檢測(cè)的報(bào)道[4-5]，但尚缺乏生蠔中大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、銅綠假單胞菌、單增李斯特菌和創(chuàng)傷弧菌的高通量檢測(cè)手段的研究。傳統(tǒng)基于選擇性培養(yǎng)基和生化分析的方法檢測(cè)這9種致病菌，具有檢測(cè)程序復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)的缺點(diǎn)，并且可能會(huì)因方法的低靈敏度和低特異性導(dǎo)致大量的錯(cuò)檢[6-7]。過去10年，基于傳統(tǒng)PCR的方法發(fā)展迅速，該方法具有分析時(shí)間短，節(jié)省人力等優(yōu)點(diǎn)[8]。

多重實(shí)時(shí)熒光串聯(lián)PCR(multiplexed tandem PCR，MT-PCR)結(jié)合了多重PCR、巢式PCR和熒光定量PCR技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)食源性致病菌的高通量快速檢測(cè)。該方法針對(duì)一個(gè)靶基因設(shè)計(jì)內(nèi)、外2對(duì)引物，首先使用混合的外引物，進(jìn)行一個(gè)循環(huán)數(shù)較少的高通量多重富集PCR，然后將第一輪多重富集PCR的產(chǎn)物用ddH2O稀釋作為第二輪的模板，其次再使用內(nèi)引物進(jìn)行第二輪巢式熒光定量PCR，結(jié)果根據(jù)擴(kuò)增曲線和熔解曲線分析。基于此原理，MT-PCR已被應(yīng)用于檢測(cè)臨床樣品中的病毒[9]、真菌[10]和轉(zhuǎn)基因食品[11]。

本研究通過設(shè)計(jì)特性引物、優(yōu)化MT-PCR參數(shù)，建立了一種可同時(shí)檢測(cè)以上9種致病菌的方法，并將該方法用于檢測(cè)人工染菌的生蠔樣品，評(píng)價(jià)了該技術(shù)的定量能力和檢測(cè)靈敏度，為快速檢測(cè)貝類產(chǎn)品中食源性致病菌提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品與菌種

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙門氏菌(Salmonella)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)，暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)，廣東省微生物菌種保藏中心，9株目標(biāo)菌株用于建立MT-PCR方法。

表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、化膿性鏈球菌(Staphylococcuspyogenes)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、沃氏葡萄球菌(Staphylococcuswarneri)、腸道沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)、霍利斯弧菌(Vibriohollisae)、擬態(tài)弧菌(Vibriomimicus)、長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)、普雷沃氏菌(Prevotellamelaninogenica)、嗜黏蛋白阿克曼菌(AkkermansiaMuciniphila)、英諾克李斯特菌(Listeriainnocua)、威爾氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、溶血鏈球菌(Streptococcushaemolyticus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)、奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)保存于暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，19株非目標(biāo)菌株用于MT-PCR特異性檢驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)采用的人工污染貝類產(chǎn)品為生蠔，廣州水產(chǎn)市場(chǎng)。

1.1.2 試劑與儀器

營(yíng)養(yǎng)瓊脂(nutrient agar medium，NA)、腦心浸出液(brain heart infusion，BHI)、3% NaCl堿性蛋白胨水(alkaline peptone water，APW)、胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂基礎(chǔ)(tryptone-sulphite-cycloserine，TSC)、液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(fluid-thioglycollate，F(xiàn)T)、胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptose soya agar，TSA)，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；DP302細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DP324海洋動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；Multiplex PCR Assay Kit Ver.2、TB Green Premix DimerEraser，大連寶生物科技有限公司。

C1000梯度PCR儀，德國(guó)Eppendorf公司；X3FR高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技有限公司；Stepone Plus熒光定量PCR系統(tǒng)，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)有限公司；LS-400無(wú)菌均質(zhì)器，上海比隆儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌的培養(yǎng)及模板DNA提取

弧菌菌株在含3%NaCl的TSA平板上活化，梭菌、厭氧菌株在TSC平板上活化，其他的好氧菌株在NA平板上活化，所有菌株活化后，挑單菌落接種于液體培養(yǎng)基，厭氧菌放置于厭氧盒中37 ℃過夜培養(yǎng)，好氧菌于37 ℃，120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。9種目標(biāo)菌株過夜培養(yǎng)后分別取1 mL菌液，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，按照說明書進(jìn)行，將DNA模板凍存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 內(nèi)外引物的設(shè)計(jì)與合成

使用primer primmer V5.0，分別針對(duì)大腸埃希氏菌的uidA基因、金黃色葡萄球菌的Nuc基因、沙門氏菌的STM4497基因、溶藻弧菌的gyrB基因[12]、副溶血弧菌的collagenase基因[12]、銅綠假單胞菌的ecfX基因[13]、單增李斯特菌的ORF2819基因，創(chuàng)傷弧菌的vvhA基因[12]和產(chǎn)氣莢膜梭菌的plc基因[14]進(jìn)行內(nèi)外引物篩選，部分序列參考已有文獻(xiàn)，所有引物序列經(jīng)NCBI-BLAST比對(duì)分析，以評(píng)估產(chǎn)生交叉反應(yīng)的可能性。驗(yàn)證后的所有引物(表1)由擎科生物科技有限公司合成。

表1 MT-PCR的內(nèi)引物和外引物Table 1 Outer and inner primer of MT-PCR

續(xù)表1

1.2.3 MT-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

第一輪多重富集PCR反應(yīng)體系：25 μL mix 2，1 μL mix 1，4.8 μL各基因外引物混合液和2 μL DNA模板混合液，用ddH2O調(diào)整體積至50 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 15 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 90 s，72 ℃ 90 s，10～20個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

將第一輪多重富集PCR產(chǎn)物用ddH2O稀釋(10～100倍)作為第二輪實(shí)時(shí)熒光定量PCR的模板，每孔體系為：10 μL TB mix，2 μL第一輪PCR產(chǎn)物稀釋液，0.4 μL各基因的內(nèi)引物，0.4 μL ROX，用ddH2O調(diào)整體積至20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)在72 ℃結(jié)束后檢測(cè)熒光信號(hào)；反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析：65～95 ℃，每0.5 ℃掃描熒光一次。

此外，分別對(duì)9種目標(biāo)菌種的DNA進(jìn)行單獨(dú)的內(nèi)引物實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)擴(kuò)增，作為對(duì)照組。qPCR的反應(yīng)程序與MT-PCR第二輪程序及體系一致。

1.2.4 MT-PCR特異性與靈敏度評(píng)價(jià)

利用9對(duì)特異性引物與9種目標(biāo)菌株和19種非目標(biāo)菌株的基因組DNA分別進(jìn)行正交測(cè)試，以驗(yàn)證MT-PCR體系的特異性。

分別培養(yǎng)9種目標(biāo)菌株至同一數(shù)量級(jí)，等比例混勻后按照10倍梯度稀釋，經(jīng)試劑盒提取DNA后再分別采用MT-PCR和qPCR進(jìn)行檢測(cè)并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線以對(duì)比2種方法的靈敏度。

1.2.5 MT-PCR檢測(cè)人工污染貝類產(chǎn)品

將生蠔組織剪碎、均質(zhì)，稱取均質(zhì)樣品25 mg，紫外照射30 min，再將樣品分別浸泡于10倍梯度稀釋的混合菌液中，染菌后樣品經(jīng)海洋動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒提取模板DNA，按照1.2.3步驟進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)MT-PCR在檢測(cè)水產(chǎn)樣品中的定量能力和靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 多重MT-PCR的優(yōu)化結(jié)果

第一輪循環(huán)數(shù)優(yōu)化結(jié)果如圖1-a所示，當(dāng)?shù)谝惠喲h(huán)數(shù)為10～15個(gè)循環(huán)，其閾值循環(huán)數(shù)(cycle threshold,Ct)值大于或接近qPCR所得Ct值，說明其靈敏度低于qPCR；當(dāng)?shù)谝惠喲h(huán)數(shù)為20個(gè)循環(huán)，MT-PCR針對(duì)9個(gè)目標(biāo)菌的Ct值小于qPCR對(duì)應(yīng)所得Ct值，且9個(gè)目標(biāo)菌株所對(duì)應(yīng)的Ct值為15左右，MT-PCR方法優(yōu)于qPCR方法。

a-第一輪反應(yīng)循環(huán)數(shù)的優(yōu)化；b-第一輪產(chǎn)物稀釋倍數(shù)的優(yōu)化圖1 MT-PCR的優(yōu)化Fig.1 The optimization of MT-PCR

對(duì)第一輪反應(yīng)的產(chǎn)物分別稀釋10、50、100倍，用作于第二輪實(shí)時(shí)熒光定量PCR的模板。結(jié)果如圖1-b所示，稀釋倍數(shù)為50、100倍時(shí)，MT-PCR擴(kuò)增所得Ct值高于或接近qPCR，熔解曲線為單峰，稀釋倍數(shù)為10倍時(shí)，其Ct值低于qPCR，且9個(gè)目標(biāo)菌株所對(duì)應(yīng)的Ct值為15左右，溶解曲線為單峰，無(wú)非特異性擴(kuò)增。

因此，在對(duì)MT-PCR的優(yōu)化過程中，為保證MT-PCR的擴(kuò)增優(yōu)勢(shì)，選擇第一輪的循環(huán)數(shù)為20個(gè)循環(huán)，第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物的稀釋倍數(shù)為10倍，作為MT-PCR反應(yīng)的條件，并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 多重MT-PCR的特異性評(píng)價(jià)

28株菌株的DNA分別與9對(duì)引物的MT-PCR正交反應(yīng)，特異性結(jié)果如表2所示，MT-PCR檢測(cè)9種目標(biāo)菌株時(shí)，只有其對(duì)應(yīng)的目標(biāo)基因經(jīng)MT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示陽(yáng)性，非目標(biāo)基因檢測(cè)結(jié)果顯示陰性。

表2 MT-PCR 特異性分析Table 2 The specificity of MT-PCR

其中19種非目標(biāo)菌株的DNA分別與9對(duì)引物的MT-PCR反應(yīng)，結(jié)果均顯示陰性，未檢測(cè)到擴(kuò)增，表明MT-PCR反應(yīng)體系中的引物序列針對(duì)非目標(biāo)菌株時(shí)無(wú)非特異性擴(kuò)增及自身無(wú)交叉反應(yīng)，即本研究建立MT-PCR方法特異性強(qiáng)。

2.3 多重MT-PCR體系靈敏度評(píng)價(jià)

10倍梯度稀釋9種食源性致病菌的混合液，提取相應(yīng)的基因組DNA，同時(shí)進(jìn)行MT-PCR和qPCR檢測(cè)以對(duì)比2種方法的定量能力和靈敏度。結(jié)果如圖2所示，2種方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，R2均>0.98，擴(kuò)增效率在90%～110%。MT-PCR針對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、銅綠假單胞菌、單增李斯特菌和創(chuàng)傷弧菌的檢測(cè)限為102～104CFU/mL，相比qPCR的檢測(cè)定量限均低一個(gè)數(shù)量級(jí)。而針對(duì)沙門氏菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌，MT-PCR和qPCR的檢測(cè)定量限一致，為102～103CFU/mL，說明MT-PCR對(duì)DNA模板的預(yù)擴(kuò)增具有一定優(yōu)勢(shì)。

a-E.coli；b-S.aureus;c-Salmonella;d-V.alginolyticus;e-V.parahaemolyticus;f-C.perfringens;g-P.aeruginosa;h-L.monocytogenes;i-V.vulnificus圖2 MT-PCR和qPCR檢測(cè)9種食源性致病菌在培養(yǎng)菌液中的靈敏度Fig.2 The sensitivity of MT-PCR and qPCR for detecting 9 foodborne pathogens in pure culture

2.4 多重MT-PCR在人工染菌生蠔樣品中的應(yīng)用

10倍梯度稀釋9種食源性致病菌的混合液，人工染菌至生蠔組織上，提取基因組DNA進(jìn)行MT-PCR擴(kuò)增。如圖3所示，MT-PCR至少可檢測(cè)該樣品中1.65×102CFU/g的大腸埃希氏菌、3.95×103CFU/g的金黃色葡萄球菌、6.58×102CFU/g的沙門氏菌、3.70×103CFU/g的溶藻弧菌、1.62×103CFU/g的副溶血弧菌、1.36×102CFU/g的產(chǎn)氣莢膜梭菌、8.24×102CFU/g的銅綠假單胞菌、1.83×103CFU/g的單增李斯特菌以及1.09×102CFU/g的創(chuàng)傷弧菌。因此，MT-PCR在生蠔樣品中應(yīng)用的檢測(cè)限范圍為102～103CFU/g。

3 結(jié)論與討論

MT-PCR方法作為一個(gè)開放的檢測(cè)系統(tǒng)，可通過增加靶基因的數(shù)量來實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，但這同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致引物的非特異性結(jié)合，因此設(shè)計(jì)并篩選出合適的引物是保證方法特異性和靈敏度的關(guān)鍵。研究表明，實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度小于200 bp有利于MT-PCR檢測(cè)[15]，因此本研究在設(shè)計(jì)內(nèi)外引物時(shí)控制外引物長(zhǎng)度在90～200 bp，內(nèi)引物長(zhǎng)度在60～110 bp。此外，所有的內(nèi)外引物均針對(duì)本研究中9個(gè)目標(biāo)菌株的特異性序列，MT-PCR針對(duì)目標(biāo)菌株和非目標(biāo)菌株的檢測(cè)結(jié)果顯示出了100%的選擇性和特異性。

第一輪較少的循環(huán)數(shù)可以確保目標(biāo)基因得到預(yù)擴(kuò)增的同時(shí)有效避免引物的競(jìng)爭(zhēng)和底物的消耗。在本研究中，第一輪反應(yīng)循環(huán)數(shù)為20，稀釋倍數(shù)為10倍時(shí)，MT-PCR針對(duì)9種目標(biāo)菌株所得的Ct值最小，比qPCR有更強(qiáng)的檢測(cè)信號(hào)。MT-PCR較高的靈敏度與其預(yù)擴(kuò)增步驟相關(guān)性較大，而本研究建立的MT-PCR方法對(duì)6種菌株的檢測(cè)定量限(102～104CFU/mL)均低于qPCR(103～105CFU/mL)也說明了這一點(diǎn)。COSTA等[16]的研究也出現(xiàn)了類似結(jié)果，其使用單管巢式實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)榛子中的過敏原，結(jié)果顯示該方法的靈敏度比普通qPCR高10倍。此外，本研究建立的MT-PCR技術(shù)的靈敏度與其他研究利用多重PCR檢測(cè)致病菌所得的檢測(cè)靈敏度具有一定的可比性。TAO等[17]基于通用引物建立的多重PCR檢測(cè)單增李斯特菌、大腸桿菌O157∶H7、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌，靈敏度在103～104CFU/mL。

a-E.coli；b-S. aureus;c-Salmonella;d-V.alginolyticus;e-V.parahaemolyticus;f-C.perfringens;g-P.aeruginosa;h-L.monocytogenes;i-V.vulnificus圖3 MT-PCR檢測(cè)人工染菌生蠔樣品中的9種食源性致病菌的靈敏度Fig.3 The sensitivity of MT-PCR for simultaneously detecting 9 foodborne pathogens in oyster

D’SOUZA等[18]使用qPCR可檢測(cè)含有102CFU/g創(chuàng)傷弧菌的蛤蜊。ZHANG等[19]使用多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR可檢測(cè)含102CFU/g副溶血弧菌、單增李斯特菌和沙門氏菌的對(duì)蝦樣品。本研究建立的MT-PCR方法可同時(shí)檢測(cè)人工染菌生蠔中的9種致病菌，靈敏度為102～103CFU/g。說明本研究建立的MT-PCR方法在實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)的同時(shí)具有較高靈敏度。

因此，本研究建立的MT-PCR方法可用于同時(shí)檢測(cè)9種病原菌，具體包括大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、沙門氏菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、銅綠假單胞菌和創(chuàng)傷弧菌，該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，且擁有比qPCR更優(yōu)或相當(dāng)?shù)亩磕芰Α４送猓琈T-PCR還適用于同時(shí)檢測(cè)生蠔樣品中多種食源性致病菌，在高通量快速檢測(cè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。