γ-聚谷氨酸對豌豆蛋白酸性環境下穩定性的影響

梁宸，陳建洋，謝新華*，忤心軍，張波波，徐超，艾志錄

1(河南農業大學 食品科學技術學院，河南 鄭州，450002)2(農業農村部大宗糧食加工重點實驗室，河南 鄭州，450002)3(鄭州市食品藥品檢驗所，河南 鄭州，450002)

豌豆蛋白(pea protein isolate, PPI)是一種天然健康的植物蛋白，其氨基酸比例平衡，賴氨酸含量豐富，具有降低膽固醇、降血壓的功能，越來越受到人們的關注[1]。PPI在pH 7.0～10.0的水溶液中表現出較好的穩定性，但PPI在等電點(約pH 4.6)附近時，因自身靜電荷被中和，發生聚集沉淀而不能起到乳化作用，限制了其在酸性飲料中的開發利用[2-3]。因此，提高PPI在等電點附近的穩定性是很有必要的。

研究表明，陰離子多糖類聚電解質可與蛋白靜電復合形成可溶性復合物，有利于提高蛋白在酸性環境下的穩定性。這是因為帶負電荷的多糖與帶正電荷的蛋白發生靜電復合后，靜電斥力和空間位阻使體系保持均勻分散的狀態；多糖的加入也使連續相的黏度增大，阻礙了大分子間的聚集[4-5]。LAN等[6]研究發現PPI和高甲氧基果膠發生靜電復合形成了網絡結構，增強了PPI的熱穩定性；LIU等[7]研究了PPI與阿拉伯膠的復合體系，發現靜電相互作用提高了PPI在酸性環境中的溶解度和乳化性；WAGONER等[8]研究發現乳清蛋白在等電點附近與果膠形成了對熱穩定的可溶性復合物，并應用到飲料產品中。γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid, γ-PGA)是谷氨酸單體以α-胺基和γ-羧基之間經酰胺鍵聯結所構成的同型聚酰胺。具有無毒、可生物降解、增稠的特性以及降低膽固醇、增強免疫力的生理活性，已廣泛應用于食品、醫療行業中[9-10]。本課題組前期的研究表明γ-PGA與大豆分離蛋白形成可溶性復合物，提高了大豆蛋白的熱穩定性[11]。目前尚未有關于γ-PGA與PPI靜電相互作用對PPI在酸性環境中穩定性影響的相關研究，本文研究了pH、復合比例、蛋白濃度對復合物形成的影響，以找到形成可溶性復合物的條件，并對復合體系的溶解度、表面疏水性、乳化性進行分析以篩選出酸性環境下穩定效果最佳的復合比例。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豌豆，市購；γ-PGA，西安四季生物科技有限公司；玉米油，中糧福臨門食品營銷有限公司；福林酚，北京博奧脫達科技有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid, ANS)，阿拉丁上海試劑有限公司；羅丹明B，西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；其余均為分析純。

1.2 儀器與設備

Virtis型凍干機，美國SP Scientific；5430R型離心機，德國艾本德公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；Zetasizer Nano ZS90電位儀，英國馬爾文儀器有限公司；T18高速剪切分散器，德國IKA儀器設備有限公司；A1激光共聚焦顯微鏡，日本尼康株式會社；Lumia熒光分光光度計，美國賽默飛世爾公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 豌豆分離蛋白的提取

參考STONE等[12]的方法，將去皮豌豆磨碎成粉后，以質量比1∶15分散在去離子水中，用0.5 mol/L的NaOH溶液將pH調至9.0，室溫下磁力攪拌2 h。4 ℃下以5 000 r/min離心20 min后收集上清液，用0.5 mol/L的HCl溶液將其pH調至4.5，4 500 r/min離心20 min后收集沉淀并分散在去離子水中，調pH至7.0，冷凍干燥后，經凱氏定氮測得蛋白含量為83.60%。

1.3.2 PPI與γ-PGA復合溶液的制備

參考LAN等[6]的方法，制備不同蛋白濃度的復合溶液。低蛋白濃度復合體系的制備：先制備PPI和γ-PGA的儲備液，質量濃度均為1.0 g/L，置于4 ℃冰箱中水化24 h。將2種儲備液按一定比例混合，加入適當體積的去離子水，配制成不同質量復合比(r=1、2、5、10、15、20)PPI-γ-PGA復合溶液(PPI濃度固定為0.5 g/L)。使用濃度分別為1.0、0.5、0.1 mol/L NaOH和HCl溶液調節復合溶液的pH為2.0～7.0，以盡量減小NaOH和HCl溶液的稀釋作用。

高蛋白濃度復合體系的制備:取水化24 h后，質量濃度均為20.0 g/L的PPI和γ-PGA儲備液，配制成PPI質量濃度固定為10.0 g/L的不同質量復合比(r=1、2、5、10、15、20)PPI-γ-PGA復合溶液，使用濃度分別為2.0、1.0、0.5、0.1 mol/L 的NaOH和HCl溶液調節pH為2.0～7.0。

1.3.3 濁度的測定

使用雙光束紫外分光光度計在波長600 nm處測定低蛋白濃度復合溶液的吸光度，以去離子水作為空白對照，每個樣品平行測定3次。

1.3.4 相圖的繪制

使用NaOH和HCl溶液將高、低蛋白濃度復合溶液的pH調至2.0～7.0后，置于玻璃瓶中于室溫下放置24 h后，記錄體系的狀態。以復合比例r為橫軸，pH為縱軸，進行相圖繪制。

1.3.5 Zeta電位的測定

使用電位儀測定高、低蛋白濃度復合溶液的Zeta電位。將復合溶液注入樣品池中，平衡時間為2 min，測定溫度25 ℃[8]。

1.3.6 蛋白溶解度的測定

采用MU等[13]的方法測定蛋白溶解度，以牛血清蛋白為標準物作標準曲線。取pH 4.5的高蛋白濃度復合溶液10 mL于離心管中，4 ℃下以 4 500 r/min離心20 min，吸取1 mL上清液將其與5 mL福林酚試劑甲混勻，室溫放置10 min后加入0.5 mL福林酚試劑乙，立即搖勻，反應30 min后測定吸光度，通過標準曲線計算樣品蛋白含量，溶解度按公式(1)計算：

(1)

1.3.7 蛋白乳化性的測定

參考ZHU等[14]的方法，略作修改。取pH 4.5的高蛋白濃度復合溶液85 mL，加入15 mL玉米油混合，使用高速剪切機于20 000 r/min下均質2 min，分別在0和10 min后從瓶底吸取50 μL乳液，用0.1 g/L十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)稀釋100倍，以SDS溶液為空白，于波長500 nm處測OD值。乳化活性計算如公式(2)所示，乳化穩定性計算如公式(3)所示：

(2)

(3)

式中：A0、A10，0、10 min測得的吸光度；DF，稀釋倍數；Φ，油相體積分數，%；θ，光路長度，cm；ρ，蛋白質量濃度，g/mL。

1.3.8 微觀結構

使用激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope,CLSM)觀測樣品的微觀結構。取1 mL pH 4.5的高蛋白濃度復合溶液，加入20 μL 2 g/L的羅丹明B，染色20 min后，吸取少量于載玻片上，物鏡倍數為20×。

1.3.9 表面疏水性的測定

使用ANS熒光探針法測定蛋白的表面疏水性[15]。通過1.3.6的方法測定pH 4.5的高蛋白濃度復合溶液的蛋白溶解度，隨后用pH 4.5的磷酸鹽緩沖液稀釋上清液，使其蛋白質量濃度分別為0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL。配制8 mmol/L的ANS，取稀釋后的樣品4 mL，加入20 μL ANS，避光放置10 min后，測定蛋白的熒光強度。設定激發波長為370 nm、發射波長470 nm，以蛋白濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標繪制曲線，曲線的斜率即為蛋白的表面疏水性。

1.4 數據統計與分析

試驗數據采用Origin 9.0軟件作圖，SPSS Statistics 25軟件進行方差分析，所有試驗均重復3次。

2 結果與分析

2.1 pH對PPI-γ-PGA復合物形成的影響

通過濁度分析來研究低濃度下蛋白與多糖的相互作用[16]。隨著pH從7.0降至2.2，PPI的濁度曲線表現出先增大后減小的趨勢(圖1)，在等電點pH 4.6時，蛋白發生聚集，濁度達到最大，隨后pH遠離等電點，蛋白分子間靜電斥力增大，濁度逐漸降低。PPI-γ-PGA的濁度曲線被分為3個相區。當pH>pHc為共溶區，此時體系的濁度沒有發生明顯變化，PPI與γ-PGA為共溶狀態。當pHφ1

由圖2可知，PPI的電位隨pH的增大不斷降低，在pH 4.58時其電勢為0，達到了PPI等電點。PPI-γ-PGA的電位也隨pH的增大而不斷降低，在pH 3.85時電勢為0，此時復合物分子間的靜電斥力最小，分子發生聚集沉淀，體系的濁度達到最大，在圖1中pHopt出現在3.8附近，也是與此對應。與PPI相比，PPI-γ-PGA體系的等電點往酸性的方向移動，可能是γ-PGA上的陰離子羧基與PPI表面的陽離子氨基通過靜電結合形成了復合物，γ-PGA 攜帶的負電荷使復合物的等電點發生了改變[16]。

圖2 pH對復合溶液ζ-電位的影響Fig.2 Effect of pH on zeta potential of mixed solution

2.2 復合比例對PPI-γ-PGA復合物形成的影響

研究了低蛋白濃度時復合比例對復合物形成的影響。參考LAN等[6]和LIU等[18]的方法確定了臨界轉變點(pHs)，當pH>pHs時，有可溶性復合物生成，體系狀態為可溶相，當pH

圖3 復合比例對pHs的影響Fig.3 Influence of mixing ratio on pHs

2.3 不同蛋白濃度對復合物形成的影響

由于濁度分析只適合研究低濃度下蛋白與多糖的相互作用，通過相圖分析來研究濃度對復合物形成的影響。PPI與γ-PGA復合水溶液在不同的pH條件下表現為清晰、渾濁、部分相分離以及完全相分離4種狀態。清晰和渾濁表明體系都為可溶相，部分相分離及完全相分離表明體系為不溶相。與LAN等[6]的研究相似，在相圖中存在可溶相與不溶相的邊界線。在低蛋白濃度下，上方的白色可溶相區域隨復合比例的減小而增大(圖4-a)，表明與相轉變相關的臨界轉變點也向酸性方向移動，這與pHs隨復合比例變化的結果相一致。與圖4-a相似，圖4-b也觀察到可溶相區域隨復合比例的減小而增大的現象，表明高濃度下pHs也隨復合比例的減小而減小；但圖4-b中黑色不溶相的區域更大，可溶相與不溶相的邊界線向上方移動，說明pHs較低蛋白濃度復合體系有所增大。

a-低蛋白質量濃度(0.5 g/L)；b-高蛋白質量濃度(10.0 g/L)圖4 復合體系的相圖Fig.4 Phase diagram of the mixed system

研究了2種蛋白濃度下復合體系電位隨pH變化的情況，見圖5。

a-低蛋白質量濃度(0.5 g/L)；b-高蛋白質量濃度(10.0 g/L)圖5 pH對復合溶液的ζ-電位的影響Fig.5 Effect of pH on zeta potential of mixed solution

圖5中電位曲線的變化表明復合比例與體系的電位表現出一定的依賴性。復合比例影響著形成復合體系整體的電荷數量，當復合比例r由20減小到1時，體系中的γ-PGA數量增大，此時有更多的γ-PGA提供負電荷，當其與PPI攜帶的正電荷發生中和后，體系的電荷量發生改變，復合溶液的電位曲線整體向下移動。在圖5中也觀察到PPI的等電點向酸性方向移動，表明靜電相互作用提高了PPI在酸性條件下的穩定性。注意到2種蛋白濃度下復合體系的電位較為接近，但在相圖中高蛋白濃度體系卻更不穩定，如pH 4.5時，高蛋白濃度體系僅有復合比r=1與r=2中無相分離出現，而低蛋白濃度體系在復合比例為r=5時，體系中便未出現相分離。這可能是因為高蛋白濃度下，體系中的大分子數量較多，此時需要更多的γ-PGA來提供陰離子羧基與PPI上的氨基結合，以提供更強的靜電斥力來阻止分子間的聚集[19]。

2.4 微觀結構

對pH 4.5時高蛋白濃度的復合體系進行了微觀結構分析。圖中綠色區域為蛋白，黑色區域為水相或多糖相。圖6-d～圖6-g中可以看到蛋白發生了大范圍的聚集，而在圖6-c中蛋白僅發生了小范圍的聚集，表明γ-PGA開始起到了一定的阻止聚集的作用。圖6-a、圖6-b中可以看到大分子均勻分散的狀態，表明PPI與γ-PGA形成了可溶性復合物，體系保持穩定。樊雪靜等[20]通過激光共聚焦也發現，單獨的大豆分離蛋白在pH 6.0時出現小范圍聚集，而大豆分離蛋白和寡糖形成的可溶性靜電復合物卻能保持分散。

2.5 PPI與γ-PGA相互作用對蛋白溶解度的影響

蛋白質的溶解度影響著蛋白質的乳化性，通常溶解度高的蛋白質具有較高的界面遷移率[21]。圖7為高蛋白濃度復合體系在pH 4.5時的溶解度。隨著復合比例由大變小，溶解度先降低后升高。當復合比例r=10、15、20時，蛋白溶解度比PPI略低，這可能是因為當γ-PGA分子數量較少時，PPI與γ-PGA發生橋聯絮凝，在龐淑婕等[22]的研究中也發現了相似的現象。當r≤5時，復合體系的溶解度顯著升高(P<0.05)，在r=1時達到了最大值52.46%，這與MOLINA等[23]在大豆分離蛋白和卡拉膠復合體系的研究結果相似。隨著復合比例的減小，體系中γ-PGA的數量增大，其與PPI形成復合物后，復合物表面的電荷數量增多，分子間的靜電斥力增大，蛋白溶解度增大。

a-r=1；b-r=2；c-r=5；d-r=10;e-r=15；f-r=20；g-PPI圖6 pH 4.5時不同復合比例下的微觀結構Fig.6 Microstructure of different mixing ratios at pH 4.5

圖7 pH 4.5時不同復合比例下的蛋白溶解度Fig.7 Protein solubility at different mixing ratio at pH 4.5注：小寫字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.6 PPI與γ-PGA相互作用對乳化性和表面疏水性的影響

研究表明，蛋白的乳化能力與蛋白質自身的溶解特性、蛋白組成、分子大小、柔韌性以及表面疏水性有關，通常疏水性越強，蛋白吸附在界面上的能力越強，乳化能力越好[24]。圖8為不同復合比例下蛋白的表面疏水性。

圖8 pH 4.5時不同復合比例下PPI的表面疏水性Fig.8 Surface hydrophobicity of PPI at different mixing ratio at pH 4.5

隨著復合比例由大變小，蛋白的表面疏水性顯著增大(P<0.05)，表明靜電相互作用使PPI內部的一些疏水基團暴露出來，提高了蛋白的表面疏水性，同時這也說明蛋白的三級結構發生了變化[25]。觀察到r=5的表面疏水性最大，但在圖9中并未表現出最佳的乳化性能，這是因為此時蛋白溶解度較低的原因，盡管蛋白能較快吸附在界面上，但參與乳化的蛋白的數量遠小于r=1和r=2的體系[26]。

圖9為pH 4.5時不同復合比例下PPI的乳化活性與乳化穩定性。隨著復合比例由大變小，乳化活性與乳化穩定性先降低后增大。

圖9 pH 4.5時不同復合比例下PPI的乳化活性和乳化穩定性Fig.9 Emulsification activity and emulsification stability of PPI at different mixing ratio at pH 4.5

這是因為當復合比較高時(r=10、15、20)，蛋白溶解度與表面疏水性都較低。圖5-b的電位數據也表明此時體系整體的靜電斥力較低，無法阻止大分子間的聚集。當體系中的大多數蛋白發生沉淀，參與乳化的蛋白數量太少不足以包裹油滴時，小油滴便逐漸聚集成大油滴，體系發生乳析分層[27]。隨著復合比例的降低，γ-PGA與PPI通過靜電相互作用形成了可溶性復合物，溶解度與表面疏水性的增大使參與乳化的蛋白分子數量增多，界面吸附能力增強，因此乳化活性得到改善。此外可溶性復合物的形成也增大了體系的靜電斥力和空間位阻，PPI-γ-PGA復合物包裹油滴后，液滴之間彼此排斥，乳液穩定性增強[22]。

3 結論

通過研究pH、復合比例、蛋白濃度對PPI與γ-PGA靜電復合的影響，發現在酸性環境下低蛋白濃度與高蛋白濃度的復合體系都表現出pHs隨復合比例減小而減小的現象。在高蛋白濃度(10.0 g/L)，當pH<4.5時，γ-PGA沒有起到足夠強的穩定作用，各個復合體系中都有沉淀出現。而在pH 4.5時，復合比r≤2的體系因具有較大靜電斥力在微觀和宏觀上都能保持穩定；靜電相互作用使蛋白的溶解度和表面疏水性增大，改善了蛋白的乳化能力。當r=1時，蛋白的乳化活性與乳化穩定性最好。綜上，通過PPI與γ-PGA的靜電復合可以提高PPI在酸性條件下的穩定性。