大豆蛋白纖維聚集體Pickering乳液提高β-胡蘿卜素的包埋穩定性

吳子涵，陳澤平，劉震宇，季扶云，萬世園，鄭志

(合肥工業大學 食品與生物工程學院，安徽 合肥，230009)

由有機凝膠乳液、雙層乳液、Pickering乳液等構建的乳液系統可以提高脂溶性營養成分的穩定性[1]。Pickering乳液是一種由固體顆粒穩定的乳液輸送系統，具有穩定性強、抗奧氏熟化、安全性好等優點[2]。在食品領域，已有文獻報道將蛋白質Pickering乳液用于營養物質的傳送，認為其較厚的界面顆粒層可以起到保護屏障的作用，確保被封裝的營養成分免受化學降解[3]。Pickering乳液的穩定性主要與液滴的特性密切相關，液滴間的相互作用是決定乳液穩定性的最主要因素。鹽離子可以通過靜電屏蔽作用影響乳液液滴間的相互作用力，從而影響乳液的穩定性。DELAHAIJE等[4]研究發現，NaCl濃度為150 mmol/L時，乳液發生絮凝，乳液的粒徑顯著增加，乳液貯藏穩定性降低。同時食品體系中一般含有鈉鹽和鈣鹽，而蛋白質及其穩定的乳液又易受環境中鹽離子的影響，因此研究鹽離子對Pickering乳液的穩定性于食品乳液體系具有十分重要的意義。

蛋白質纖維聚集體是指在遠離等電點pH值和低離子強度條件下，對蛋白質進行長時間的熱處理，形成的富含β-折疊結構的微米級或納米級絲狀纖維。由于纖維聚集體獨特的絲狀結構和較高的橫縱比，使其在乳液形成和穩定方面表現出優異的性能[5]。相比于β-乳球蛋白，β-乳球蛋白原纖維具有優越的乳化活性和更高的穩定性[6]。大豆分離蛋白是一種資源豐富且氨基酸全面的蛋白質，富含天門冬氨酸和谷氨酸，容易形成蛋白纖維[7]。然而，關于大豆蛋白纖維聚集體制備Pickering乳液以及蛋白纖維聚集體Pickering乳液對生物活性物質包埋穩定性的研究較少報道。

β-胡蘿卜素是類胡蘿卜素的一種，存在于很多果蔬之中，具有抗癌、抗氧化和預防心血管疾病等功能[8]。β-胡蘿卜素是一種脂溶性營養成分，在氧、熱及光存在的條件下，容易發生氧化降解，導致其在運輸、儲存、食品應用等方面受到了很大的限制[9]。目前，β-胡蘿卜素多以乳液的形式裝載，與傳統乳液相比，Pickering乳液具有更強的穩定性可以更好包埋β-胡蘿卜素。本研究利用酸熱處理制備大豆分離蛋白纖維聚集體，探究蛋白濃度、油相比例和NaCl濃度對蛋白纖維聚集體乳液制備及其穩定性的影響，同時研究該纖維聚集體乳液在不同離子濃度下對β-胡蘿卜素的包埋效率及貯藏穩定性的影響，研究結果可為大豆分離蛋白纖維聚集體在包埋活性物質中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂豆粕，山東禹王公司；β-胡蘿卜素，上海麥克林生化科技有限公司；大豆油，益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司；其他試劑均為分析純。

Fluko-FA25高速剪切乳化劑機，上海Fluko公司；Nicolet67傅里葉變換紅外光譜儀，美國Thermo公司；JEM-1400flash透射電子顯微鏡，日本電子公司；F97 Pro熒光光譜儀，上海棱光技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆分離蛋白(soy protein isolated, SPI)的提取

參考王金梅等[10]的方法，以料液比1∶15(g∶mL)向低溫脫脂豆粕加入去離子水，調節pH值為8并攪拌3 h，8 000×g離心30 min后，取上清液過濾，并將濾液pH值調節至4.5。以6 500×g離心30 min，取沉淀。水洗沉淀2次，加水溶解并將其pH值調至7.0，4 ℃透析48 h，凍干備用。

1.2.2 大豆分離蛋白纖維聚集體(soy protein isolate fibril, SPIF)的制備

稱取SPI凍干粉溶于去離子水中，制成質量濃度40 g/L的溶液，室溫攪拌5 h后，靜置水合過夜。用2 mol/L HCl溶液調節溶液pH值至2.0，以8 000×g離心30 min，上清液用0.45 μm的濾膜進行抽濾，用預調至pH 2.0的去離子水調節溶液至終質量濃度20 g/L。將樣品90 ℃恒溫水浴8 h，溫和攪拌。結束后立即冷卻至室溫，放置于4 ℃冰箱中儲藏備用[11]。

1.2.3 SPIF乳液的制備

用pH 2.0的去離子水將SPIF溶液濃度稀釋至不同質量濃度(2.5、5、10和20 g/L)，加入不同濃度的NaCl(0、200、400、600、800、1 000 mmol/L)攪拌均勻，以不同的油相比例(0.4、0.6、0.8)加入大豆油混合。15 000 r/min剪切乳化2 min，得到SPIF乳液。

1.2.4 包埋β-胡蘿卜素的SPIF乳液的制備

將0.2 g β-胡蘿卜素溶于200 mL大豆油中，磁力攪拌器充分攪拌2 h至β-胡蘿卜素完全溶解。將油相與一定濃度的SPIF溶液按一定比例充分混勻后，以15 000 r/min剪切2 min，4 ℃冷藏保存，在相同條件下以SPI溶液制備乳液作為對照組。所有的容器均使用鋁箔紙包裹，以最大程度的保護β-胡蘿卜素，減少在制備過程中的損失[12]。

1.2.5 SPIF的表征

1.2.5.1 硫黃素T(thioflavin T,ThT)熒光分析

將8 mg ThT溶解于10 mL 磷酸緩沖液(10，150 mmol/L NaCl，pH 7.0)中，過0.22 μm的濾膜得到ThT母液[13]。對母液稀釋50倍后得到ThT工作液。取40 μL樣品溶液(10 g/L)與4 mL ThT工作液混合，于室溫反應2 min。激發波長設置為440 nm，對460～600 nm波長進行掃描[14]。

1.2.5.2 傅里葉紅外光譜分析(Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR)

取SPI和SPIF的凍干粉，使用傅里葉紅外光譜儀進行全波長掃描(400～4 000 cm-1)，隨后用Peakfit 4.12軟件對蛋白質二級結構進行擬合分析。

1.2.5.3 透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)

對SPI和SPIF溶液用預調至pH 2.0的去離子水稀釋至1 mg/mL，取10 μL滴在銅網上，多余溶液用濾紙吸干，自然干燥24 h，用TEM觀察微觀形貌。

1.2.6 SPIF乳液的表征

1.2.6.1 不同條件下乳液的外觀觀察

將不同蛋白濃度(2.5、5、10和20 g/L)，不同離子強度(0、200、400、600、800、1 000 mmol/L)和油相比例(0.4、0.6、0.8)的SPIF乳液置于室溫環境下靜置一段時間后，進行外觀拍照觀察。

1.2.6.2 乳化活性(emulsification activity index,EAI)和乳化穩定性(end system identifier,ESI)測定

根據劉昊天等[15]的方法稍作修改，取3 mL 20 g/L的SPIF溶液分別加入不同濃度的NaCl，攪拌均勻，與1 mL大豆油混合，以15 000 r/min剪切2 min，立即從離心管管底取樣50 μL，用1 g/L SDS溶液稀釋100倍。振蕩混勻后以1 g/L SDS溶液作為空白，讀取樣品在500 nm波長處的吸光值記作A0 min，樣品放置10 min后再次在相同位置取樣50 μL，重復上述步驟記錄A10 min。樣品的EAI和ESI分別按公式(1)(2)計算：

(1)

(2)

式中：ρ,樣品質量濃度，g/L；φ,油相比例；N,稀釋倍數。

1.2.6.3 乳液的界面蛋白吸附率

參照江連洲等[16]的方法，取1 mL新制的乳液在13 000×g下離心45 min后，乳液分離為上層乳析層和下層水相，將離心管頂部的乳析層小心移除，用一次性注射器取出下層清液。取100 μL清液用水稀釋至1 mL，使用考馬斯亮藍法測蛋白含量Cf，C0為乳液中的總蛋白含量。乳液的界面蛋白吸附率按公式(3)計算：

界面蛋白吸附率/%=(C0-Cf)×100/C0

(3)

1.2.7 包埋β-胡蘿卜素的SPIF乳液性質

1.2.7.1 β-胡蘿卜素的包埋率

參照SURH等[17]的方法，在1 mL的乳液中加入3 mL的正己烷，振蕩30 s。混勻后8 000×g離心5 min。取上清液于10 mL容量瓶中用正己烷定容。置于紫外分光光度計中測定在450 nm處的吸光值。利用β-胡蘿卜素標準曲線計算其中β-胡蘿卜素的含量，由此測出的含量即為未被包埋的β-胡蘿卜素的含量(μg/mL)。用公式(4)計算：

(4)

1.2.7.2 脂肪上浮率

按照曹亞倩等[18]的方法，取10 mL新制備的乳液置于西寧瓶中，豎直放置于4 ℃下貯藏。同時記錄不同時間(0、1、2、4、7、15 d)的下清液層高度(Hs)和總高度(Ht)，脂肪上浮率按公式(5)計算。

(5)

1.2.7.3 光學顯微鏡

取新鮮制得的乳液1 mL，并稀釋5倍，然后取40 μL滴加到載玻片上，蓋上蓋玻片，在20倍鏡下觀察液滴分布。

1.2.7.4 貯藏穩定性

將β-胡蘿卜素乳液置于西寧瓶中于55 ℃下貯藏7 d。每隔1 d取β-胡蘿卜素乳液1.0 mL，分別加入乙醇和正己烷(1∶2，體積比)。振蕩，取上清液。用分液漏斗重復萃取3次，合并上層萃取液，并于10 mL容量瓶中定容，測其在450 nm處的吸光值[19]。根據β-胡蘿卜素標準曲線計算出β-胡蘿卜素的質量濃度(μg/mL)，結果以ρ/ρ0表示，其中ρ為貯藏一定時間后乳液中β-胡蘿卜素的質量濃度(μg/mL)，ρ0為乳液中β-胡蘿卜素的初始質量濃度(μg/mL)。

1.2.8 統計分析

每個實驗重復3次，結果以平均值±標準差表示，采用SPSS Statistics進行顯著性分析，當P<0.05時認為差異顯著。

2 結果與討論

2.1 SPIF的表征

2.1.1 ThT熒光分析

ThT熒光分析在研究中常被用于定性檢測蛋白的纖維結構，其熒光強度會隨著纖維聚合物的增加而上升[20]。從圖1-a中可發現在酸性條件下(pH 2.0)加熱8 h后，SPI在486 nm處的最大熒光強度顯著增加。圖1-b顯示加熱8 h后，SPI樣品的熒光強度值從97.67增加至333.70，提升了241.7%，說明SPI經酸熱處理后自組裝形成了具有β-折疊結構的纖維聚合物SPIF。

圖1 不同加熱時間對SPI的熒光光譜和熒光強度的影響Fig.1 Fluorescence spectrum and fluorescence intensity of SPI under different heating time注：不同小寫字母代表差異顯著，P<0.05,(下同)

2.1.2 FTIR分析

表1 不同加熱時間下的SPI樣品的二級結構 單位：%

2.1.3 微觀形貌

TEM常用于物質微觀形貌的觀察。根據圖2-a可以觀察到未加熱的SPI樣品為圓球狀顆粒，在pH 2.0條件下加熱處理8 h，20 g/L SPI形成很多細而長的線狀聚合物，即大豆分離蛋白納米纖維。SPIF長短不一，其直徑在幾至十幾納米，都具有較高的橫縱比(圖2-b)。

a-0 h；b-8 h圖2 不同加熱時間下SPI的TEM形貌圖Fig.2 Transmission electron microscope morphology of SPI under different heating time

2.2 SPIF乳液的表征

2.2.1 乳液的外觀觀察

不同蛋白濃度和油相比的乳液外觀如圖3所示。新制備的乳液均包含上層的乳液層和下層的水相層，隨著SPIF濃度的增加，相同油相比例下的乳液層的厚度逐漸增加，說明大豆油被成功分散，增加SPIF的濃度可以更好地穩定Pickering乳液體系[18]。當SPIF質量濃度達到20 g/L時，乳液幾乎沒有分層，可得出最適蛋白濃度為20 g/L。但是在油相比例0.8時，乳液頂部有析油現象，說明蛋白濃度為20 g/L的SPIF不足以包裹住全部油滴表面，可得出0.6為最適油相比例，因此選取20 g/L蛋白濃度和0.6的油相比例進行后續實驗。

圖3 不同蛋白濃度和油相比例下的乳液外觀Fig.3 The emulsion appearance in different protein concentrations and oil fraction

NaCl的靜電屏蔽效應會導致乳液液滴的進一步聚集，不同濃度的Na+會對乳液的穩定性造成一定影響。從圖4中發現，鹽離子的添加有效地增加了乳液層的厚度，顯著提高了SPIF乳液的穩定性。同時添加NaCl的乳液未分層，且隨著時間的增加，乳液的表觀狀態并沒有發生改變，各個離子濃度的乳液變化肉眼難以識別。

圖4 不同離子強度下0和7 d的乳液外觀Fig.4 The emulsion appearance at 0 and 7 d with different ionic strengths

2.2.2 乳化活性和乳化穩定性分析

由圖5可見，相對于SPI，SPIF的乳化活性和乳化穩定性明顯增加。

a-乳化活性；b-乳化穩定性圖5 不同離子強度下SPIF的乳化特性Fig.5 Emulsifying properties of SPIF at different ionic strengths

隨著鹽離子濃度的增加，SPIF的乳化活性和乳化穩定性均呈現先增高后下降的趨勢。當離子強度為600 mmol/L時，SPIF的乳化活性和乳化穩定性最高。這可能是由于鹽離子的加入屏蔽了SPIF之間的靜電斥力，降低了分子間的空間位阻，使得SPIF可以更好地包裹住油滴表面，增加了SPIF的乳化性能[23]。但是當NaCl濃度繼續增加時，SPIF因靜電斥力的減小相互聚集成更大的團聚體，不利于在油滴表面的吸附。并且隨著液滴間的靜電斥力進一步減小，使得乳液液滴之間發生相互聚集，降低了乳液的穩定性[23]。綜上在適當的鹽離子濃度下，SPIF的乳化活性和乳化穩定性會有一定的提高。

2.2.3 界面蛋白吸附率

如圖6所示，隨著離子強度的增加，蛋白乳液的界面蛋白吸附率逐漸上升。當離子強度達到600 mmol/L時，界面蛋白吸附率的增加逐漸趨于平穩。這可能是由于纖維聚集體間靜電斥力減弱，使得蛋白結構的柔順性更好，可高效且穩定的吸附于油水界面[16]。然而過高的離子強度會使乳液液滴間絮凝，從而界面蛋白吸附率進一步增加，但是乳液的穩定性下降。

圖6 不同離子強度下SPIF乳液的界面蛋白吸附率Fig.6 Percentage of adsorbed protein of SPIF emulsion under different ionic strengths

2.3 包埋β-胡蘿卜素的SPIF乳液的表征

2.3.1 包埋率

SPI與SPIF在不同離子強度下對β-胡蘿卜素的包埋率如圖7所示。

圖7 不同離子強度下SPI和SPIF乳液對β-胡蘿卜素的包埋率Fig.7 Encapsulation efficiency of β-carotene in SPI and SPIF emulsions under different ionic strengths

在0 mmol/L時，SPIF乳液對β-胡蘿卜素的包埋率為95.78%，相較于SPI乳液的83.36%，提高了12.42%。SPIF乳液對β-胡蘿卜素的包埋率隨著離子強度的增加而增加，當離子強度大于200 mmol/L時，包埋率為98.2%以上。而SPI乳液對β-胡蘿卜素的包埋率隨著離子強度的增加先上升后下降，說明SPI乳液易受到環境中鹽離子的影響。

2.3.2 脂肪上浮率

脂肪上浮率通常用來表征乳液的穩定性，乳液的不穩定會加速脂肪上浮的現象。圖8-a顯示，SPI乳液(0～1 000 mmol/L)儲存一段時間后都出現了不同程度的脂肪上浮。鹽離子的添加降低了SPI乳液的脂肪上浮率，原因可能是離子強度的增加使得乳液的黏度增加，在一定程度上阻礙了脂肪的上浮[24]。從圖8-b發現鹽離子的添加顯著減少了SPIF乳液的脂肪上浮率，當離子強度大于200 mmol/L時，SPIF的脂肪上浮率僅在4.2%以下。并且隨著時間的增加，SPIF的脂肪上浮率沒有變化，說明鹽離子極大地提高了SPIF乳液的穩定性。

a-SPI；b-SPIF圖8 不同貯藏時間下包埋β-胡蘿卜素乳液的脂肪上浮率Fig.8 Cream index of emulsions encapsulated β-carotene at different storage times

2.3.3 光學顯微鏡

圖9為不同離子強度包埋β-胡蘿卜素的SPI和SPIF乳液的微觀結構，乳液微觀結構是最為直觀地表征乳液穩定性的方法。在SPI乳液中，液滴分布不均，液滴大小不一。隨著鹽離子的添加，乳液液滴粒徑變大，且有液滴聚集現象發生，這可能與乳液液滴較大有關。

圖9 不同離子強度下包埋β-胡蘿卜素SPI(a,b,c,d,e,f)和SPIF(A,B,C,D,E,F)乳液的顯微鏡觀察圖Fig.9 Microscopic observation of SPI (a,b,c,d,e,f) and SPIF (A,B,C,D,E,F) emulsions encapsulated β-carotene at different ionic strengths

相較于同樣離子強度下的SPI乳液，SPIF乳液液滴大小明顯減小，且大小較為均一，分布較為一致，乳液乳化穩定性強。TANG等[25]發現蛋白結構的柔性是影響乳化性的重要因素。SPIF的乳化性比SPI要好，可能是因為SPIF的線性構象柔順性更好，相比SPI可以更高效地吸附在界面上。并且在鹽離子濃度低于800 mmol/L的情況下，隨著離子強度的增加乳化體系中液滴大小沒有明顯變化，進一步說明了SPIF乳液具有較強的耐鹽性。

2.3.4 貯藏穩定性

β-胡蘿卜素在光、熱條件下易氧化分解，減少β-胡蘿卜素的降解是提高生物利用率和穩定性的有效途徑[8]。測定了乳液中β-胡蘿卜素在55 ℃儲藏過程的保留率，結果如圖10所示。

a-SPI；b-SPIF圖10 不同離子強度下乳液中β-胡蘿卜素的貯藏穩定性Fig.10 Storage stability of β-carotene in emulsions with different ionic strengths

β-胡蘿卜素在乳液中的含量會隨著時間逐漸降低。在未添加鹽離子的情況下，SPIF乳液中β-胡蘿卜素第7天的保留率為60.28%，相對于SPI乳液提高了7.46%。β-胡蘿卜素在SPI和SPIF乳液中的保留率均隨著鹽離子濃度的增高先升高后降低，且均高于未添加鹽離子時的保留率，說明鹽離子的添加在一定程度上有利于減少β-胡蘿卜素的降解。在儲藏第7天，當離子強度為200 mmol/L時，β-胡蘿卜素在SPI乳液中的保留率達到最大72.39%；SPIF乳液中β-胡蘿卜素的保留率在600 mmol/L時達到最大值81.46%。這說明SPIF乳液能更好地穩定β-胡蘿卜素，并且具有更好的耐鹽性。

3 結論

SPI通過酸熱處理后，自組裝生成了具有大量β-折疊結構的SPIF。透射電鏡圖片顯示SPIF是一種細而長的纖維狀結構，具有很高的橫縱比。SPIF的乳化活性和乳化穩定性均高于SPI。界面蛋白吸附率的變化證明離子強度的增加使SPIF更好地吸附在乳液液滴表面，從而增加了乳液的穩定性。同時SPIF乳液相對于SPI可以更好地包埋β-胡蘿卜素，提高乳液中β-胡蘿卜素的儲藏穩定性，并且SPIF乳液還可以更好地抵抗環境中鹽離子的干擾。通過觀察乳液的微觀結構發現，SPI乳液在高鹽離子濃度下粒徑隨著離子強度的增加而明顯增大，而SPIF乳液液滴分布均勻，具有一定的耐鹽性。本研究有助于擴展SPIF在穩定Pickering乳液和包埋生物活性物質的開發中的應用。