棘頭梅童魚肝型脂肪酸結合蛋白基因克隆及組織表達分析

歐陽文杰 宋煒 陳佳 桂福坤 程家驊 謝正麗 馮廣朋

(1 浙江海洋大學，國家海洋設施養殖工程技術研究中心，浙江舟山 316022； 2 中國水產科學研究院東海水產研究所，農業農村部遠洋與極地漁業創新重點實驗室，上海 200090； 3 福建福鼎海鷗水產食品有限公司，大黃魚育種國家重點實驗室，福建寧德 352103； 4 中國水產科學研究院漁業機械儀器研究所，農業農村部漁業裝備與工程技術重點實驗室，上海 200092)

脂肪酸結合蛋白(fatty acid binding proteins，FABPs)屬于脂結合蛋白超家族成員，是一類分子量較小而對脂肪酸有高親和力的可溶性蛋白質，廣泛分布于哺乳動物的腸道黏膜、肝臟、腎臟、心臟、肌肉、腦、脂肪組織等組織細胞中，其功能主要是參與細胞對脂肪酸的攝取、細胞內脂肪酸的轉運及代謝調節，也參與調節細胞生長和分化、機體免疫等[1-4]。自1972年首次發現該蛋白以來，根據被分離出的組織及其主要結構，已鑒定出18種不同的脂肪酸結合蛋白[5-8]。不同類型的FABP基因序列之間具有較高的同源性，目前普遍認為它們是由魚類和哺乳動物分化之前的一個共同祖先進化而來的[9]。肝型脂肪酸結合蛋白(liver fatty acid binding protein，L-FABP)是脂肪酸結合蛋白家族的重要成員，對長鏈脂肪酸(LCFAs)有較高的親和力，可以介導脂肪酸由細胞膜轉運到氧化和合成的部位，在LCFAs的代謝中發揮著至關重要的作用[10]。目前已在斑馬魚(Daniorerio)[11]、綠河鲀(Tetraodonnigroviridis)[12]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[13]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[14]和雀鱔(Lepisosteusoculatus)[15]等少數魚類中克隆得到L-FABP基因序列。研究表明，斑馬魚和綠河鲀的L-FABP基因主要在腸道中表達，草魚和虹鱒的L-FABP基因主要在肝臟中有表達，而雀鱔的L-FABP基因在心臟中的相對表達量最高。

棘頭梅童魚(Collichthyslucidus)隸屬于鱸形目(Perciformes)、石首魚科(Sciaenidae)、梅童魚屬(Collichthys)。該魚適溫、適鹽范圍廣，廣泛分布于我國近海和河口地區，是重要的小型底棲經濟魚類[16-17]。棘頭梅童魚肉質細嫩，味道鮮美，脂肪酸種類多樣，富含鮮味氨基酸，必需氨基酸組成合理，具有較高的營養價值[18]。目前，有關棘頭梅童魚的研究主要集中在形態分類[19-20]、早期發育[21-22]、遺傳結構[23-24]和生化成分[25]等方面，尚未見關于該魚脂類營養需求及其調控方面的報道。本研究克隆得到了棘頭梅童魚L-FABP基因的cDNA序列，進行了相關生物信息學分析，并檢測了其在不同組織中的表達特異性，以期為進一步研究L-FABP基因在棘頭梅童魚營養調控、脂肪酸代謝和免疫應答等方面的功能提供基礎資料。

表1 棘頭梅童魚L-FABP基因克隆和熒光定量PCR檢測所用引物

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗用棘頭梅童魚為2021年9月9日從閩東海域采集的野生棘頭梅童魚，共16尾，平均體質量為(20.36±11.98)g，平均體長為(9.91±2.31)cm。解剖試驗魚并取其不同組織(胃、鰓、肝臟、腸道、眼、大腦、心臟、肌肉、脾臟、頭腎和中腎)，放入液氮中速凍，置于-80 ℃冰箱中保存，用于RNA提取。

1.2 RNA提取及cDNA合成

參照Trizol試劑(Beyotime)說明書提取各組織樣本的總RNA。用微量分光光度計(BioTeke ND5000)檢測提取RNA樣品的濃度和純度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。使用ReverTra Ace qPCR RT Kit試劑盒(TOYOBO)合成互補DNA(cDNA)，置于-20 ℃冰箱保存，用于后續基因克隆和熒光定量(qRT-PCR)分析。

1.3 L-FABP基因克隆

以Gan等[17]全基因組測序組裝數據為基礎，在Ensembl基因組數據庫中獲取墨西哥脂鯉(Astyanaxmexicanus)、斑馬魚、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)、綠河鲀、劍尾魚(Xiphophorushelleri)和大黃魚(Larimichthyscrocea)的L-FABP基因序列，進行BLAST比對(10-10)，獲得棘頭梅童魚L-FABP基因的含開放閱讀框(open reading frame,ORF)的cDNA序列。在L-FABPcDNA序列上、下游設計驗證引物(見表1)，擴增產物送上海杰李生物技術有限公司進行測序。

1.4 生物信息學分析

用Vector NTI 11.5.1軟件預測棘頭梅童魚L-FABP基因的ORF，推測其編碼的氨基酸序列；使用在線工具ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)計算氨基酸分子量和等電點等理化性質；利用InterProScan在線網站(https://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)對蛋白結構域進行預測；利用在線工具UCL(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)預測蛋白質的二級和三級結構；用SignalP-5.0 Server在線網站(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測L-FABP的信號肽；采用Clustal X軟件對棘頭梅童魚L-FABP基因的氨基酸序列與其他物種進行多序列比對，并在MEGA 7軟件中，使用Maximum Likelihood method(最大似然估計法)的LG+G模型構建系統發育樹，設置Bootstrap為1 000。

注：方框內為起始密碼子；*為終止密碼子；下劃線為脂質/胞質性脂肪酸結合結構域；灰色陰影為多聚腺苷酸化信號。

1.5 組織表達分析

L-FABP基因的特異性引物使用Primer Premier 5軟件及NCBI數據庫設計，β-actin作為內參基因(見表1)。使用cDNA為模板，選擇TB Green?PremixExTaqTM(TaKaRa)作為定量反應試劑，根據Bio-Rad CFX96TM型熒光定量PCR儀進行qRT-PCR反應。qRT-PCR反應體系為20 μL：10 μL TB GreenPremixExTaq，0.4 μL ROX Reference Dye(50×)，6.8 μL ddH2O，上、下游引物各0.4 μL，2 μL 10倍稀釋后的cDNA模板。反應程序為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共40個循環；最后60～95 ℃獲得熔解曲線并確認擴增引物的特異性。

1.6 數據分析

使用2-ΔΔCT方法測定不同組織中L-FABP基因的相對表達量。試驗數據采用Prism 8軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan’s法多重比較檢驗組間差異的顯著性并繪圖，設P<0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 棘頭梅童魚L-FABP基因序列

克隆得到棘頭梅童魚L-FABP基因的含ORF的cDNA序列為475 bp，其中5’-UTR(非翻譯區)為51 bp，3’-UTR為40 bp，在3’-UTR區域能找到明顯的多腺苷酸化信號(PAS)AATAAA序列。起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，ORF為384 bp，編碼127個氨基酸，分子量為13.90 kDa，等電點(pI)值為5.59，不穩定系數(II)為22.51，判斷為穩定蛋白，脂溶指數(AI)為87.32，總平均親水性(GRAVY)為-0.346。通過蛋白結構域預測分析，找到編碼蛋白在第3～126位點有脂質/胞質性脂肪酸結合結構域(見圖1)。根據UCL和SWISS-MODEL預測結果，棘頭梅童魚L-FABP基因的氨基酸結構由10個β-折疊鏈和2個α-螺旋鏈構成(見圖2)。SignalP-5.0 Server的結果表明，在棘頭梅童魚L-FABP基因氨基酸序列中未發現信號肽(見圖3)。

2.2 系統進化分析

將棘頭梅童魚L-FABP基因氨基酸序列提交至NCBI，通過blastp比對氨基酸同源性。結果表明，棘頭梅童魚L-FABP基因氨基酸序列與大黃魚一致性最高，相似性為96.06%。與條紋狼鱸(Moronesaxatilis)、赤鋸鱗魚(Myripristismurdjan)、白梭吻鱸(Sanderlucioperca)等物種的一致性為92.13%(見表2)。使用Clustal X軟件進行多序列比對，結果表明，棘頭梅童魚L-FABP基因氨基酸序列與其他物種相比，具有41個絕對保守位點(同一性100%)，其中賴氨酸(Lys)、甘氨酸(Gly)及蘇氨酸(Thr)出現的頻率最高(見圖4)。使用MEGA 7軟件繪制系統發育進化樹，結果發現，棘頭梅童魚L-FABP基因可與其他物種L-FABP基因聚類，與大黃魚有較高的同源性，置信度為81，而與綠河鲀的同源性較低(見圖5)。

2.3 L-FABP基因在不同組織的表達水平

L-FABP基因在棘頭梅童魚肝臟、腸道、眼、大腦、心臟、肌肉、胃、鰓、脾臟、頭腎和中腎共11個組織中均有表達(見圖6)，且存在組織表達差異性。棘頭梅童魚肝臟中的L-FABP基因相對表達量顯著高于其他組織中的(P<0.05)，腸道、肌肉組織次之，頭腎、心臟、眼睛、鰓、胃和大腦中的L-FABP基因相對表達量較低，中腎和脾臟中的L-FABP基因相對表達量最低。

表2 棘頭梅童魚與其他物種同源L-FABP基因的相似性

3 討論

本研究成功克隆出棘頭梅童魚L-FABP基因的cDNA序列，并對其氨基酸序列進行了分析，試驗發現，棘頭梅童魚L-FABP基因含有脂質/胞質性脂肪酸結合結構域，與魚類和其他水生無脊椎動物FABPs中所發現的保守結構域一致[26]。預測得到的蛋白質結構為10條反向平行的β-折疊鏈和2條短的α-螺旋鏈，符合傳統FABPs基因家族成員的蛋白質結構特點[27]。氨基酸序列比對結果表明，棘頭梅童魚L-FABP基因的氨基酸序列與其他魚類相比，具有41個絕對保守位點，其中Lys、Gly、Thr出現的頻率最高，推測其可能與維持L-FABP基因在棘頭梅童魚進化過程中的生物學功能穩定有關。利用L-FABP進行的系統發育分析結果顯示，棘頭梅童魚與大黃魚(石首魚科)同源性很高，與淡水鯊魚、斑馬魚及尼羅羅非魚同源性僅為75%左右，符合傳統分類地位。

FABPs基因家族成員蛋白對脂肪酸有很高的親和力，在脂肪酸代謝過程中起著重要作用。其主要功能是在脂肪酸進入細胞后，將其轉運到不同的位點進行代謝或者儲存，同時也參與調節脂肪酸氧化和代謝，并通過參與脂類合成從而影響細胞生長分化。因此，FABPs基因家族成員蛋白在各生物的不同組織，如肝臟、腸道、肌肉和心臟等廣泛分布。本研究主要針對棘頭梅童魚FABPs基因家族中的L-FABP基因在不同組織中的表達進行研究。研究發現，L-FABP基因廣泛分布于多種組織中，與L-FABP基因在卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)組織中的表達模式相似[28]。肝型脂肪酸結合蛋白(L-FABP)對長鏈脂肪酸(LCFA)在細胞內的轉運具有重要作用，且具有信號轉導分子的功能，是機體能量代謝的重要環節[29]。在哺乳動物中，L-FABP基因主要分布于肝臟、腸道、腎臟和胰腺中[30]。而L-FABP基因在不同魚類不同組織的分布差異較大，草魚的L-FABP基因在肝臟中相對表達量最高，其次是后腸、脾臟和后腎，在前腸、中腸、心臟、頭腎、肌肉和鰓中的相對表達量較低[13]。虹鱒[14]和矛尾復蝦虎魚(Synechogobiushasta)[26]的L-FABP基因也是在肝臟中相對表達量最高。斑馬魚和綠河鲀的L-FABP基因主要在腸道中富集[11-12，31]。斑點雀鱔的L-FABP基因在心臟組織中相對表達量最高[15]。本研究中，L-FABP基因在棘頭梅童魚不同組織中的表達也存在差異，在肝臟中的相對表達量顯著高于其他組織中的(P<0.05)，說明肝臟是棘頭梅童魚脂質合成和脂肪水解的核心部位。基因的表達功能與其在組織中的特異性表達緊密相關。脂肪轉運的內源性途徑(endogenous pathway)就是通過肝臟將合成的脂肪轉運至機體其他組織貯藏或利用的過程，因此，肝臟是脂肪代謝的重要場所。根據棘頭梅童魚L-FABP基因在肝臟中的高相對表達量可以推斷，肝臟參與合成大量的脂肪，為維持其穩態，高含量的脂肪酸會促進L-FABP基因進行轉錄翻譯，從而將過多的脂肪酸運出肝臟，或轉運至線粒體中氧化分解。因此推測，L-FABP基因在參與棘頭梅童魚脂肪酸轉運和吸收，以及肝臟對脂肪酸的調節和代謝的過程中具有相關作用，該基因在肝臟中具體的生物學功能值得進一步探究。L-FABP基因在棘頭梅童魚肌肉中的相對表達量也較高，推測原因，可能是棘頭梅童魚在運動過程中的肌肉舒張和收縮需要消耗大量的能量，從而促進L-FABP蛋白轉運脂肪酸至線粒體進行氧化分解，由此為機體供能；也有可能與本研究采集的棘頭梅童魚正處于性腺發育成熟期有關，說明此階段棘頭梅童魚肌肉中脂代謝活動旺盛。

注：標注字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)，字母相同表示組間差異不顯著(P>0.05)。

4 結論

本研究克隆得到了棘頭梅童魚L-FABP基因的含ORF的cDNA序列，通過多序列比對和系統發育分析，證明該基因與其他魚類的肝型脂肪酸結合蛋白基因高度相似。L-FABP基因廣泛分布于棘頭梅童魚不同組織中，猜想L-FABP基因在棘頭梅童魚不同組織中均發揮作用，且在脂代謝途徑中發揮不同的功能作用，這為后期功能驗證創造了條件。本研究結果有助于進一步認識魚類脂肪酸結合蛋白，也為棘頭梅童魚營養及免疫調控分子機制研究提供了基礎資料。