虎杖及多種植物提取物的抗氧化功效研究

杜可欣 蔣一博 陳 軍 牟維林

(煙臺新時代健康產業日化有限公司，煙臺 264006)

近年來，隨著自由基學說迅速發展，衰老和多種疾病的發生已被證實與自由基的過量產生有密切關聯。因此，想到達延緩皮膚衰老的效果可從抑制自由基的產生與清除現有自由基兩方面進行研究，傳統的抗氧化劑一般來源于化學合成，存在穩定性差、毒副作用強等缺點，而來自植物的天然抗氧化劑具有安全無毒、穩定性強、天然等優勢更符合消費者要求，有些得到了極大的開發利用。天然抗氧化劑的研究一方面可為行業提供更安全高效的選擇，另一方面也可為弘揚中草藥植物成分貢獻一份力量。

超氧化物歧化酶(以下簡稱SOD)是一種金屬酶，廣泛分布在微生物、動物和植物體內。它能夠催化超氧陰離子自由基(O2-)歧化生成氧(O2)和過氧化氫(H2O2)，在機體氧化與抗氧化平衡中起到關鍵性作用，同時SOD作為機體中清除自由基的天然活性物質，在機體的自我保護系統中也起到至關重要的作用。DPPH清除測定法于1958年被提出，至今被廣泛應用于生物試樣與酚類等物質抗氧化能力的定量測定中，測定原理是根據DPPH自由基有單電子，在517nm處具有強吸收，其醇溶液呈紫色的特性。當有自由基清除劑存在時，DPPH單電子與自由基清除劑進行配對，使其吸收逐漸消失，醇溶液顯色反應開始減弱，顯色程度與其接受的電子數量成定量關系，因而可用分光光度計進行快速的定量分析。

虎杖作為一種重要的中藥材，被收錄于藥典中。因虎杖中含有黃酮類、酚類以及單糖類化合物，具有抗炎、抗菌、抗氧化等功效?；⒄忍崛∥铮饕砂邹继J醇和大黃素組成，研究顯示白藜蘆醇和大黃素表現出廣泛的抗氧化特性。黃芩始載于《神農本草經》，別名山茶根，具有清熱燥濕，止血的功效，用藥歷史悠遠，黃芩提取物、包括有黃芩苷、黃芩素等，研究表明黃芩及其有效成分具有廣泛的藥理作用，如抗炎、抗氧化和免疫調節等。紅景天生長在高海拔且極寒的地域，惡劣的環境造就了其超強的生命力，可作藥用，能夠補氣清肺，益智養心。紅景天根部的提取物主要成份為紅景天苷和甙元酪醇，具有增強免疫功能、保護心腦血管及抗氧化的作用。甘草始載于《神農本草經》中，甘草以根及其根莖入藥，主要成分是三萜類和黃酮類還含有生物堿等。甘草除了補脾益氣、清熱解毒等功效，在護膚領域被大家熟知的是美白功效。本研究比較了虎杖、黃芩、紅景天及甘草的抗氧化作用，旨在為抗氧化產品的開發提供試驗依據。

1 實驗材料與方法

1.1 材料與試劑

黃芩、虎杖、紅景天、甘草、葛根、瑪咖、青梅、松花粉、HaCaT細胞、DPPH細胞、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 樣品制備

1.2.1 原料前處理

表1 待檢樣品編碼與原料前處理方法

1.2.2 待檢樣品溶液制備

取經過前處理好的1%濃度的待檢原料溶液40μl，加入到3960μl培養液中，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，得濃度為10μg/g待檢樣品。

1.3 試劑配制

1.3.1 細胞培養及細胞裂解液的制備

37℃、5% CO2條件下，培養足夠數量的HaCaT細胞，將細胞濃度調整到5個/ml，接入6孔培養板中，每孔加入3ml細胞懸液，培養12h后，棄上清，加入上述檢測原料，繼續培養24h后，棄上清，每個樣品孔加入2ml的無血清培養液，用細胞刮將細胞轉移到離心管中，超聲探頭保持在液面以下，將細胞超聲破碎。功率為300W，冰水浴，每3～5s超聲1次，間隔4次(每次間隔時間30 s左右)。

1.3.2 SOD活性檢測試劑配制

①底物應用液的配制：底物儲備液：緩沖液按1∶200的比例混勻配成底物應用液，現用現配，2℃～8℃可保存7天。

②酶工作液的配制：酶儲備液：酶稀釋液按1∶10的比例混勻配成酶工作液，現用現配，2℃～8℃可保存3天。

1.3.3 DPPH抑制率檢測試劑配制

配制濃度為0.5mmol/ml的DPPH溶液：稱取2.958mg DPPH，用甲醇溶解并定容于15ml的容量瓶中，避光保存于0℃～4℃環境中。

2 檢測方法

2.1 SOD酶活性檢測

按照表2檢測程序對經原料溶液處理過的細胞進行SOD酶活性檢測。

表2 檢測程序列表

混勻，37℃孵育20min，波長450nm，酶標儀測定吸光度值，參考波長630nm。

酶活力抑制率計算:在本反應體系中SOD抑制率達到50%時所對應的酶量為一個SOD活力單位(U)。按公式計算SOD的抑制率：

當時，錢鐘書的鄰居林徽因女士也養貓，稱家里那只貓是他們一家“愛的焦點”。兩家的貓經常打架，錢家的貓太小，常常受鄰居貓的“欺負”。

SOD抑制率(%)=

抑制率越大，表明測定樣品的SOD酶活性越高。在本試劑盒測定原理中用抑制率代表SOD酶活性的變化，即抑制率代表樣品處理后細胞SOD酶活性提高的百分比，如果抑制率越高則表明原料對培養細胞SOD酶活性的促進作用越強。

表2 DPPH的抑制率

2.2 DPPH抑制率檢測

①取樣品稀釋液2ml及濃度為0.5mmol/ml的DPPH溶液0.5ml，先后加入同一具塞試管中，搖勻，在黑暗中37℃放置20min，以甲醇為空白在514nm測定其吸光度Ai。

②取0. 5ml 0.5mmol/ml的DPPH溶液與2ml甲醇混合，搖勻，在黑暗中37℃放置20min，以甲醇為空白在514nm測定其吸光度Ao。

③取2ml樣品稀釋液與0.5ml甲醇混合，搖勻，在黑暗中37℃放置20min，以甲醇為空白在514nm測定其吸光度Aj。

樣品對DPPH的抑制率的計算:

抑制率(%)=[1-(Ai-Aj) /Ao]×100

3 結果與分析

3.1 各樣品對SOD酶活性的影響

表3 待檢原料對SOD酶活性的影響

圖1 使用超氧化物歧化酶(SOD)測定

樣品稀釋萬分之一后，使用酶標儀，在波長450 nm時檢測其OD值。并且根據公式，與對照組相比，計算各樣品組的SOD抑制率。其中3號樣品抑制效果比較明顯，3號為虎杖的醇提物。該結果表明虎杖醇提物中具有能提高細胞內SOD酶活性的成分，經3號樣品處理后可使細胞內酶活性提高20%左右，從而提高了細胞的抗氧化性能。另外樣品1-A號、樣品4號、5號及8-A號也顯示出一定的提高細胞內SOD酶活性的能力。

所謂的自由基就是當機體進行代謝時，能奪去氧的一個電子，這樣這個氧原子就變成自由基。自由基很不穩定，它要從組織細胞的分子中再奪取電子來使自己配對，當細胞分子失去一個電子后，它也變成自由基，又要去奪取細胞膜或細胞核分子中的電子，這樣又會產生新的自由基。如超氧化物陰離子自由基、羥自由基、氫自由基和甲基自由基，等等。在細胞中由于自由基非常活潑，化學反應性極強，參與一系列的連鎖反應，能引起細胞生物膜上的脂質過氧化，破壞膜的結構和功能。自由基對皮膚的損傷是一個重要的因素，對已生成的自由基進行清除，就可以有效的減緩皮膚的衰老。

超氧化物歧化酶簡稱SOD，按其所含金屬輔基不同可分為三種，第一種是含銅、鋅金屬輔基的稱(Cu.Zn-SOD)，是最為常見的一種酶，呈綠色，主要存在于機體細胞漿中；第二種是含錳金屬輔基的稱(Mn-SOD)，呈紫色，存在于真核細胞的線粒體和原核細胞內；第三種是含鐵金屬輔基的稱(Fe-SOD)，呈黃褐色，存在于原核細胞中。SOD是氧自由基的自然天敵，為自由基清除劑，廣泛存在于生物體的各種組織中，能清除自由基O2-(超氧陰離子自由基)。而O2-具有細胞毒性，可使脂質過氧化，損傷細胞膜，引起炎癥、腫瘤和自身免疫性疾病，并可能促使機體衰老。羥自由基在細胞中非常活潑，化學反應性極強，能引起細胞生物膜上的脂質過氧化，破壞膜的結構和功能。自由基對皮膚的損傷是一個重要的因素，對已生成的自由基進行清除，就可以有效地減緩皮膚的衰老。

3.2 各樣品對DPPH的抑制率的影響

用分光光度計在波長514nm時測定各樣品的Ao、Ai以及Aj的OD值，根據公式計算出樣品對DPPH的抑制率，用GraphPad軟件作圖2。各樣品都具有抑制DPPH自由基的作用，其中樣品5(葛根)、樣品7(青梅)、樣品1-B(黃芩水提液)的抑制作用比較明顯。

圖2 用DPPH自由基清除實驗檢測樣品對清除能力的影響

在皮膚衰老的過程中，自由基對皮膚的損傷是一個重要的因素。對已生成的自由基進行清除，就可以有效地減緩皮膚衰老。DPPH 為1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一種穩定的氮中心自由基，廣泛用于定量測定抗氧化能力。本實驗的原理是根DPPH自由基有單電子，在514nm處有一強吸收，其醇溶液呈紫色的特性。當有自由基清除的藥品存在時，由于與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其接受的電子數量成定量關系，因而可用分光光度計在波長514nm檢測并進行快速的定量分析。

4 結論

綜上所述，虎杖提取物具有明顯的促進細胞內SOD酶活性的能力，可使細胞內SOD酶活性提高20%左右，黃芩、紅景天提取物也顯示出一定的提高SOD酶活性的能力，且各樣品均具有抑制DPPH自由基的作用，作為天然的抗氧化成分，在護膚品領域具有一定的開發潛力。