甘草次酸對子宮內膜癌細胞增殖、凋亡、侵襲遷移的影響及機制

袁建暉 范燕燕 胡小青

江西省婦幼保健院腫瘤科，江西南昌 330000

子宮內膜癌是發生于子宮內膜的一組上皮性惡性腫瘤，在婦科中較為常見，占婦科惡性腫瘤的7%左右，是發病率較高的女性生殖系統惡性腫瘤之一[1]。近年來，隨著女性生存壓力的增加，以及生活、工作等方式的變化，子宮內膜癌的發生率逐年上升，且呈現出一定的年輕化趨勢，極大威脅到女性的健康和安全[2]。甘草是我國常見的食藥同源性中藥，在中醫學中已被廣泛應用，具有補中益氣、清熱解毒、去痰止咳等功效，是治療疾病的良藥[3]。甘草的主要成分為甘草次酸，該成分是一種齊墩果烷型五環三萜化合物，已被研究證實有保護心臟再灌注、抑制炎癥反應、抗病毒等功效，在肝癌、胃癌、食管癌等惡性腫瘤中，可以抑制腫瘤細胞的增殖，誘導細胞凋亡及抑制腫瘤細胞的侵襲轉移，具有良好的抗癌效果[4]。但是從目前臨床研究來看，甘草次酸在婦科惡性腫瘤，尤其是生殖系統惡性腫瘤中應用的報道并不多見，因此其作用及機制還有待深入探究，對子宮內膜癌的防治有十分重要的指導意義。為此，本研究就甘草的主要成分甘草次酸對子宮內膜癌細胞增殖、凋亡、侵襲遷移的影響及機制展開探究，旨在為臨床提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

人子宮內膜癌Ishiawa 細胞，由上海生命科學院細胞中心提供。胎牛血清、DMEM 培養基等，購自美國Gibco 公司。MTT 試劑，購自美國Invitrogen 公司。流式細胞儀，購自美國Ambion 公司。細胞凋亡檢測試劑盒，購自日本TaKaRa 公司。Transwell 小室，購自美國Corning 公司。

1.2 方法

1.2.1 分組處理 分為實驗組及對照組，實驗組甘草次酸的濃度設置為：20、40、80、160、320 μmol/L，對照組為加二甲亞楓（dimethyl sulfoxide，DMSO）終濃度不高于2%的培養基。

1.2.2 藥物配制及細胞培養 子宮內膜癌Ishikawa 細胞為江西省婦幼保健院實驗室保存的細胞株。甘草次酸用DMSO 稀釋成50 mmol/L，-20℃分裝保存，使用前解凍，并稀釋為不同的濃度。使用10%胎牛血清的RIMI1640 培養液，于37℃、5% CO2飽和濕度的細胞培養箱內進行培養，取處于對數位生長期且臺盼藍拒染法測定活性在95%以上的細胞進行試驗。

1.2.3 MTT 法檢測細胞增殖 于96 孔板中接種子宮內膜癌Ishikawa 細胞，于培養箱中進行培養，各組分別加入不同濃度甘草次酸干預24、48、72 h 后去液（20、40、80、160、320 μmol/L），空白孔是不含細胞的RIMI1640 培養液，每孔加入20 μl MTT 溶液，繼續培養。4 h 后去液，加入150 μl DMSO，平板離心機10 min。酶標儀上570 nm 波長處檢測其OD 值，記錄相關數據，實驗重復3 次。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 于6 孔板中接種細胞，不同濃度甘草次酸（80、160、320 μmol/L）干預24 h 后用胰酶消化細胞，PBS 洗滌2 次，收集細胞，加入Binding Buffer 500 μl 懸浮細胞。然后加入10 μl Annexin V，4℃避光反應5 min；之后上流式分析儀檢測，1、2、3 h 內檢測細胞凋亡情況，記錄相關數據，實驗重復3 次。

1.2.5 Transwell 小室檢測細胞侵襲力和遷移的變化用50 mg/L Matrigel 膠1∶8 稀釋包被Transwell 小室膜的上室面，4℃過夜，使膠面在上室分布均勻，加入血清液，37℃孵育30 min，培養細胞，調整濃度為2×105/ml，接種細胞，將200 μl 細胞懸液加入上室，下室加入500 μl 含10%小牛血清的培養液，每組設3 個平行孔，培養細胞12～72 h，取出小室，用PBS 洗2～3 遍后酒精固定30 min，將小室風干，0.1%結晶紫染色20 min，計數貼壁細胞，計算細胞的侵襲力。去除Matrigel 膠，重復上述步驟，即可計算細胞的遷移力。

1.2.6 蛋白印跡法檢測經過甘草次酸處理過的子宮內膜癌細胞中Caspase-9 的表達情況 提取經過甘草次酸處理過1、2、3 h 的子宮內膜癌細胞Ishiawa 蛋白，用移液槍量取1 ml 索來寶RIPA 緩沖液+10 μl PMSF，反復抽吸并置于冰上靜置制得所需蛋白。BCA法測蛋白濃度：配制BCA 工作液，以562 nm 吸光度為標準值，最后計算蛋白濃度。選擇配制10% 5ml 的分離膠及2 ml 積層膠。制好的“三明治”夾以“黑對黑、白對白”電轉膜條件為：80 mA 恒流電流105 min冰水水浴中進行。封閉、抗體的孵育、eECL 顯影及結果統計：一抗的孵育：配制一抗封閉液，4℃冰箱中保存過夜。將過夜孵育的一抗放置于水平搖床上，室溫下1 h。二抗的孵育：室溫下水平搖床上孵育1 h。按康為世紀發光試劑盒說明書指導配制發光液，放置Bio-Rad 于成像儀上，顯示出影像清楚的條帶后拍照，統計結果。

1.3 統計學方法

采用SPSS 21.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間行單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t 檢驗，行Pearson 相關性分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 甘草次酸對Ishiawa 細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

甘草次酸不同濃度組Ishiawa 細胞72 h 增殖抑制率高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），甘草次酸濃度升高時，Ishiawa 細胞72 h 增殖抑制率升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。不同濃度兩兩比較，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖1）。

圖1 甘草次酸對Ishiawa 細胞增殖的抑制作用

甘草次酸不同濃度組Ishiawa 細胞凋亡率高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），甘草次酸濃度升高時，Ishiawa 細胞凋亡率升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。不同濃度兩兩比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

甘草次酸不同濃度組Ishiawa 細胞遷移和侵襲數量少于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），甘草次酸濃度升高時，Ishiawa 細胞遷移和侵襲數量減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。不同濃度兩兩比較，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 甘草次酸對癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響

2.2 甘草次酸對Ishiawa 細胞中Caspase-9 表達的影響

甘草次酸處理后的Ishiawa 細胞中Caspase-9 表達低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；且甘草次酸處理濃度升高時，Caspase-9 表達量下降，差異有統計學意義（P＜0.05）（表2）。

表2 甘草次酸對Ishiawa 細胞中Caspase-9 表達的影響

2.3 Caspase-9 表達水平與細胞凋亡、增殖、侵襲率的相關性

Pearson 相關性分析顯示，Caspase-9 表達水平與細胞凋亡率呈負相關，與細胞增殖率和侵襲率呈正相關，差異有統計學意義（P＜0.05）（表3）。

表3 Caspase-9 表達水平與細胞凋亡、增殖、侵襲率的相關性

3 討論

子宮內膜癌是臨床最為常見的婦科生殖系統惡性腫瘤之一，具有非常高的發生率，隨著惡變程度的加深，會極大地威脅患者的健康乃至安全，早已引起全社會的廣泛關注[5-7]。目前，對于子宮內膜癌的研究，多集中在臨床治療方面，但是有關其具體分生物學分子研究并不太多。

在一項關于肉瘤HOS 和HT1080 細胞系的研究中發現，甘草次酸可以通過阻滯G0/G1細胞周期而抑制細胞增殖作用[8]。在肝癌細胞中，甘草次酸通過誘導凋亡發揮作用，通過激活胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號通路，增加乳酸脫氫酶的釋放、增加凋亡蛋白Bax 的表達、促進Caspase-3 蛋白的剪切、激活微管相關蛋白輕鏈3-Ⅱ（light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）的表達和自噬小體的形成，從而促進肝癌細胞的凋亡[9-12]。甘草次酸可以抑制腫瘤細胞的侵襲轉移[13-14]，有研究通過下調侵襲轉移相關因子基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）MMP-2、MMP-9 和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的產生，從而抑制乳腺癌細胞的侵襲轉移[15]。本研究結果顯示，甘草次酸會對子宮內膜癌Ishiawa 細胞的增殖、凋亡、遷移侵襲產生影響，且隨著處理濃度的不斷增加，產生的作用和效果更加明顯。Caspase-9 是被證實的凋亡因子，在許多信號通路上均有表達，通過對凋亡因子表達的分析，可以初步探討甘草次酸在癌癥細胞中的作用機制[16-17]。同時甘草次酸針對在子宮內膜癌細胞中的研究尚未開展，本研究旨在明確甘草的主要成分甘草次酸在子宮內膜癌細胞中的作用，為子宮內膜癌的中藥特色治療提供理論基礎。王銘等[18]研究發現，衣霉素可抑制活化的HSC 增殖，促進其凋亡，并上調Caspase-9 蛋白的表達。本研究結果顯示，甘草次酸處理后的Ishiawa 細胞中Caspase-9 表達低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；且甘草次酸處理濃度升高時，Caspase-9 表達量下降，差異有統計學意義（P＜0.05），且Caspase-9 表達水平與細胞凋亡率呈負相關，與細胞增殖率和侵襲率呈正相關（P＜0.05），提示甘草次酸可以調控Caspase-9 蛋白的表達，而子宮內膜癌細胞的增殖、凋亡、遷移侵襲作用可能與之有關。

綜上所述，甘草次酸對子宮內膜癌細胞增殖、凋亡、侵襲遷移會產生影響，其機制可能是通過調控Caspase-9 的表達而實現。