建立穩定表達人有機陰離子轉運體OAT1 細胞的活性檢測方法及抑制劑的篩選*

韓學誠，唐雪妮，夏宗玲

1 南京醫科大學附屬常州二院 藥學部，常州 213003;2 常州市德安醫院 藥劑科，常州 213000;3 蘇州大學附屬第三醫院 藥學部，常州 213000

人有機陰離子轉運體1（human organic anion transporter 1，hOAT1）是位于腎臟的主要藥物轉運體之一，可介導將血液中的有機陰離子轉運到近端小管上皮細胞內，與尿酸分泌和排泄密切相關[1]，并在藥物和毒物的排泄中發揮重要作用。6-羧基熒光素與尿酸轉運蛋白1[2]、OAT1[3]都有很強的親和力，常被選為再攝取抑制試驗的底物，用于活性檢測與抑制劑的篩選。在臨床診療中，多種藥物聯合使用常存在競爭或協同作用，因此針對hOAT1 轉運體底物及抑制劑的研究有助于指導臨床安全用藥。本研究旨在建立hOAT1 細胞中經典底物含量的檢測方法，用于hOAT1 細胞活性的測定及其抑制劑的篩選。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

HERA cell 150 CO2細胞孵育箱（Thermo scientific）；GI80DP 高壓滅菌器（致微（廈門）儀器有限公司）；CKX41 顯微鏡（OLYMPUS）；SYNERGY2 多功能酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；萬分之一電子分析天平（塞多利斯科學儀器（北京）有限公司）；5427R 高速臺式離心機（德國Effendorf 公司）；旋渦混合器（上海醫科大學儀器廠）；HD-1030A 超聲波清洗儀（寧波市凌大超聲波設備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

6-羧基熒光素（6-CF，批號C105327）、替格瑞洛活性代謝產物（ARC 124910XX，批號CAS220347-05-7，純度95%），奧美沙坦（批號O124944）、厄貝沙坦（批號I129263）、替米沙坦（批號T129239）、丙磺舒（批號P129440），純度均≥98%，均購于南京倍爾博實驗器材公司；替格瑞洛原藥（石藥集團歐意藥業，批號20000816-574210314，純度99.6%）；阿托伐他汀鈣、辛伐他汀、瑞舒伐他汀鈣（浙江江北制藥公司，批號分別為20201228、20210310、20210324，純度均≥99%）；纈沙坦原料藥（常州四藥廠，批號A202104301，純度≥99.9%）；Gibco DMEM 杜氏改良Eagle 培養基（DMEM）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、胎牛血清（Thermo Fisher Scientific）；Hank’s 平衡鹽溶液（無酚紅，伊勢久連云港生物科技公司）；胰酶細胞消化液（0.25%胰酶）、青霉素-鏈霉素溶液（100X）、二辛喹酸（BCA）蛋白測定試劑盒（均碧云天生物技術公司）；水為超純水。

1.3 細胞

空載體pcDNA3.1（+）的犬腎傳代細胞（MDCK）（陰性對照組，簡稱MDCK-mock），細胞（第三代）及MDCK-hOAT1 細胞（第六代），由浙江大學藥物分析與代謝實驗室贈予；培養液為含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、100 U·mL-1青霉素-鏈霉素的DMEM 培養基，于37℃、5% CO2條件下培養。當細胞生長至80%～90%融合度時，通過胰酶消化傳代。

2 方法與結果

2.1 溶液的配制

2.1.1 6-CF 貯備液 精密稱取6-CF 3.53 mg 置于100 mL 量瓶中，加Hank’s 溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻。取該溶液0.8 mL 置于10 mL 量瓶中，加Hank’s 溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得8 μmol·L-1的6-CF 溶液。

2.1.2 抑制劑篩選溶液 精密稱取經典抑制劑丙磺舒5.62 mg、待篩選藥品瑞舒伐他汀鈣20.78 mg、替米沙坦10.34 mg、奧美沙坦9.42 mg、厄貝沙坦7.5 mg、纈沙坦9.22 mg，置于10 mL 量瓶中，加Hank’s 溶液溶解并稀釋至刻度，混勻得2 mmol·L-1的溶液，待用。精密稱取待測藥品替格瑞洛10.04 mg、替格瑞洛活性代謝產物（ARC124910XX）10.02 mg、辛伐他汀8.62 mg、阿托伐他汀鈣24.84 mg，置于10 mL 量瓶中，加二甲基亞砜（DMSO）20 μL 溶解后，置于37℃恒溫超聲儀內，逐漸加入Hank’s 溶液溶解并稀釋至刻度，混勻得2 mmol·L-1的溶液，待用。每次用前超聲溶解30 min。

2.1.3 細胞裂解液 稱取氫氧化鈉0.2 g 置于15 mL試管中，加滅菌注射用水10 mL，溶解，搖勻，即得。

2.2 樣本處理與測定

樣本處理：將MDCK-hOAT1 細胞及MDCKmock 細胞按密度1×105cell/孔種于24 孔板，在37℃、5% CO2條件下培養48 h 后，進行經典底物6-CF 的攝取實驗。每株細胞分為兩組，一組為底物組，另一組為抑制劑篩選組，每組平行3 份。細胞用37℃Hank’s 清液洗兩遍，底物組加250 μL 含6-CF 4 μmol·L-1的Hank’s 溶液，抑制劑篩選組加250 μL含4 μmol·L-16-CF 和1 mmol·L-1抑制劑的Hank’s溶液，37℃孵育5 min。用冰冷的PBS 溶液500 μL 洗3 次，終止孵育。最后采用0.5 mol·L-1的NaOH 溶液250 μL 裂解細胞，反復吹勻后移至96 孔板中，待測。

樣品熒光吸光度測定：采用SYNERGY2 多功能酶標儀，樣品在激發波長485 nm、發射波長520 nm處檢測熒光吸光度。

樣品蛋白濃度測定：釆用BCA 蛋白測定試劑盒測定細胞裂解中蛋白濃度。測定步驟：①工作液配制：按50 體積BCA 試劑A 加1 體積試劑B 配制適量工作液，混勻后室溫放置，24 h 內穩定。②工作曲線制備：取適量蛋白標準液，用純化水稀釋至濃度為0.5 mg·mL-1。分別取0、2、4、8、16、20 μL 標準液至96孔板中，加純化水補足至20 μL。③取稀釋后的待測樣品20 μL 至96 孔板中，待測樣品與標準蛋白液各加入200 μL BCA 工作液，37℃反應30 min。④采用SYNERGY2 多功能酶標儀測定各孔在562 nm 處的吸光度，根據標準曲線計算待測樣品蛋白濃度。

以6-CF 的熒光吸光度對蛋白濃度的比值作為6-CF 的細胞內積聚量指標，用于衡量轉運體hOAT1 活性的指標[4]。抑制作用為化合物降低MDCK-hOAT1 攝取6-CF 進入細胞內的比率，該值越高表示化合物抑制作用越強。

2.3 標準曲線的制備

取一定量6-CF 貯備液，加Hank’s 溶液稀釋成含6-CF 0.08、0.16、0.32、0.8、1.6、3.2 μmol·L-1的系列溶液，按“2.2”項下方法處理后檢測，記錄6-CF的積聚量對蛋白濃度的比值。以溶液中待測物6-CF濃度（X）為橫坐標，待測物的熒光吸光度對蛋白濃度的比值（Y）為縱坐標進行回歸分析，得回歸方程為Y=1102X+111.94（r=0.999 1）。結果表明，MDCKhOAT1 及MDCK-mock 細胞中6-CF 濃度與熒光吸光度對蛋白濃度的比值在檢測濃度0.08～3.2 μmol·L-1范圍內呈良好線性關系。

2.4 精密度試驗

取一定量6-CF 貯備液，加Hank’s 溶液稀釋成含6-CF 0.16、0.8、2.4 μmol·L-1的溶液，按“2.2”項下方法處理后上機檢測，同日內重復測定3 次、連續測定3 天，計算6-CF 的日內和日間精密度。見表1。

表1 精密度試驗結果（，n ＝3）

表1 精密度試驗結果（，n ＝3）

2.5 回收率試驗

取一定量6-CF 貯備液，加Hank’s 溶液稀釋成含6-CF 0.16、0.8、2.4μmol·L-1的溶液，按“2.2”項下方法處理后上機檢測，每個濃度進行3 個樣本分析，計算方法回收率（即將所得信號比值代入回歸方程，求得測定值，與加入量比較），結果準確度良好，見表2。

表2 回收率試驗結果（，n＝3）

表2 回收率試驗結果（，n＝3）

2.6 穩定性試驗

制備濃度為0.16、0.8、2.4 μmol·L－1的6-CF 溶液，按“2.2” 項下方法處理至“采用0.5 mol·L－1的NaOH 溶液250 μL 裂解細胞”后，將樣品放置在室溫及4℃冰箱內，分別于0、6、24、48、72 h 上機檢測激發波長A485nm、發射波長520 nm 處熒光強度，并測定的吸光度A562mm，計算蛋白濃度，計算6-CF 的濃度對蛋白濃度的比值。結果RSD 均＜6.48%，表明樣品溶液在室溫及4℃下放置72 h 內穩定。

2.7 MDCK-hOAT1 活性的測定

以MDCK-hOAT1 經典抑制劑丙磺舒為陽性對照，以MDCK-mock 為陰性對照，按“2.2”項下方法處理，上機測定MDCK-hOAT1 活性，結果見表3。

表3 MDCK-hOAT1 活性測定結果（，n＝3）

表3 MDCK-hOAT1 活性測定結果（，n＝3）

2.8 DMSO 對細胞活性的影響

針對水溶性差的待測物，在配制時使用了DMSO 助溶，配制濃度為1%、0.1%的DMSO 溶液，按“2.2”項下方法處理，上機測定其對MDCK-hOAT1的抑制作用，結果表明0.1%的DMSO 溶液對細胞活性無影響，見表4。

表4 DMSO 對MDCK-hOAT1 活性影響（n ＝3）

制備濃度為1 mmol·L－1的丙磺舒溶液、替格瑞洛、替格瑞洛活性代謝產物（ARC124910XX）、阿托伐他汀、纈沙坦、奧美沙坦、厄貝沙坦、替米沙坦、辛伐他汀、瑞舒伐他汀溶液，按“2.2”項下方法處理，上機測定其對MDCK-hOAT1 的抑制作用，結果表明1mmol·L－1替格瑞洛、替格瑞洛活性代謝產物（ARC124910XX）、阿托伐他汀、纈沙坦、奧美沙坦、厄貝沙坦、替米沙坦、辛伐他汀、瑞舒伐他汀、丙磺舒對OAT1 的抑制作用分別為19.53%、9.56%、11.17%、103.45%、110.34%、93.41%、90.33%、79.84%、95.22%、107.88%，見表5。

表5 MDCK-hOAT1 抑制劑篩選結果（n ＝3）

3 討論

人OAT1 細胞常見的經典底物有對氨基馬尿酸[4]、6-CF[5]等，由于對氨基馬尿酸需要使用高效液相聯合質譜進行含量測定，雖靈敏度高，但對儀器設備要求高，樣品處理復雜，故本研究以具有熒光吸光特性的6-CF 作為轉運體活性測定的底物，樣品處理簡單、檢測儀器可及性強，方法簡單可行。

本研究建立的MDCK-hOAT1 細胞中6-CF 含量測定方法，在0.08～3.2 μmol·L－1范圍內線性關系良好，測定方法簡捷，日內、日間精密度，回收率達到生物樣品檢定要求，用于hOAT1 細胞活性的測定與其抑制劑的篩選效果良好。

通過hOAT1 轉運體的經典抑制劑丙磺舒（陽性對照）和轉染的空載細胞MDCK-mock（陰性對照）對MDCK-hOAT1 細胞活性進行驗證，6-CF 在MDCK-mock 和MDCK-hOAT1 細胞中孵育相同時間，兩種細胞內測得6-CF 濃度，存在顯著差異（P ＜0.01），說明MDCK-hOAT1 細胞具有轉運6-CF 進入細胞內的活性。同時，兩種細胞中均加入抑制劑丙磺舒，MDCK-hOAT1 細胞轉運活性被抑制，檢測細胞內6-CF 含量降低（抑制率94.93%），MDCKmock 細胞內6-CF 含量無變化。結果表明MDCKhOAT1 細胞具有轉運活性，可用于hOAT1 轉運體相關藥物相互作用的研究。

DMSO 常用于細胞凍存液中，是一種滲透性保護劑，能夠降低細胞冰點，減少冰晶的形成，減輕自由基對細胞的損害；但其本身具有細胞毒性，有報道顯示[6]其用于明確要浸提極性物質時，細胞培養基內有機溶劑體積分數不應超過1%[6，7]，反應體系中其最終使用體積分數不宜超過0.5%。本實驗中替格瑞洛、ARC、辛伐他汀、阿托伐他汀鈣水溶性差，在溶液配制中嘗試使用1%、0.1% DMSO 終濃度進行樣品溶液配制，并通過實驗驗證在0.1% DMSO 濃度時對細胞活性無影響，不干擾抑制實驗結果。在有機陰離子轉運體相關報道中[8]，大多未提及脂溶性高的藥物在轉運體活性研究中溶液的處置方法。

抑制實驗初篩結果表明，纈沙坦、奧美沙坦、厄貝沙坦、替米沙坦、瑞舒伐他汀在與MDCK-hOAT1經典底物丙磺舒同樣濃度時，其對MDCK-hOAT1細胞轉運活性顯示出了同樣的抑制作用，其中奧美沙坦的抑制作用甚至強于丙磺舒，可進一步研究相關藥物相互作用。而替格瑞洛、替格瑞洛活性代謝產物（ARC 124910XX）、阿托伐他汀的抑制率均顯著低于丙磺舒，表明其不是MDCK-hOAT1 的抑制劑。