比較不同產(chǎn)地白術(shù)中揮發(fā)油及兩種白術(shù)內(nèi)酯活性成分的含量

黃柏益，田 薇，袁 珂，陳 磊

1 杭州華東中藥飲片有限公司，杭州 311301;2 浙江農(nóng)林大學(xué)，杭州 311300

白術(shù)為菊科植物白術(shù)[1]Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根莖。我國白術(shù)的產(chǎn)地主要分布在中部地區(qū)及江浙一帶，其中浙江是白術(shù)的道地產(chǎn)區(qū)。浙江白術(shù)是有名的“浙八味”之一，其主產(chǎn)地以新昌、磐安最著。而產(chǎn)于臨安於潛西天目山一帶的白術(shù)，由于處于獨(dú)特的地理環(huán)境，因品質(zhì)優(yōu)良而被冠為“於術(shù)”，在《浙江省中藥炮制規(guī)范》2015 年版予以收載[2]。近年來，白術(shù)在河北等地也廣為栽培。

在《中國藥典》2020 年版中，白術(shù)質(zhì)量控制方法較為簡單，無含量測定項(xiàng)。現(xiàn)建立了白術(shù)揮發(fā)油主要成分的定性分析及白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量測定方法，并比較了不同產(chǎn)地白術(shù)揮發(fā)油的組成、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量。

1 儀器與藥品、試劑

Waters 2695 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；Finnigan 氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國菲尼根公司）；十萬分之一分析天平（METTLER AE 240，瑞士）。揮發(fā)油提取器（四川蜀玻集團(tuán)公司）。甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純；水為蒸餾水。

白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ（批號1018-090908）與白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（批號1018-090812）對照品（購自江西本草天工科技有限責(zé)任公司，純度均＞98%）。臨安於術(shù)（9 批）、磐安白術(shù)（8 批）、河北白術(shù)（7 批），經(jīng)浙江農(nóng)林大學(xué)田薇教授鑒定確認(rèn)，其產(chǎn)地等信息見表1。

表1 樣品批號、采集地和揮發(fā)油總量

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油的提取與測定

2.1.1 揮發(fā)油的提取及總量測定 分別將不同產(chǎn)地白術(shù)粉碎成粗粉，各取樣50 g 左右放入1000 mL的圓底燒瓶中，加入350 mL 的蒸餾水，安裝揮發(fā)油提取器，提取揮發(fā)油至盡。收集揮發(fā)油，測量其體積，計(jì)算得油率。結(jié)果見表1。

采用水蒸餾提取檢測揮發(fā)油含量，磐安白術(shù)較臨安於術(shù)檢測值略高，河北白術(shù)最低。其中磐安白術(shù)、臨安於術(shù)飲片較河北白術(shù)分別高出71.4%、68.4%，相對含量較高，浙產(chǎn)白術(shù)有較明顯優(yōu)勢。

2.1.2 GC－MS 測定條件 氣相色譜條件[3]：色譜柱為OV-1701（30 m×0.25 mm，0.25 μm）毛細(xì)管柱；升溫程序：初始溫度50℃，保持2 min，以10℃·min-1的速度升至130℃，再以5℃·min-1的速度升至190℃；繼續(xù)以12℃·min-1的速度升至240℃，保持4 min；進(jìn)樣口溫度200℃，氣化室溫度250℃；載氣為氦氣，流速：0.8 mL·min-1；分流比30∶1，進(jìn)樣量：0.1 μL。

質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源；電離能量70eV，離子源溫度200℃，檢測器電壓350 V，掃描質(zhì)量范圍：m/z：33～450 AMU；掃描速度0.5 s；檢索的圖譜數(shù)據(jù)庫為Willey 和NIST 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫。

2.1.3 測定結(jié)果 取於術(shù)1（批號211004）、磐安10（批號210913）、河北20（批號211101）3 批樣品揮發(fā)油，按“2.1.2”測定條件進(jìn)行分析化合物的定量，采用面積歸一化法，使用Hewlett-Packard 軟件處理系統(tǒng)計(jì)算各峰面積，以測得揮發(fā)油各組分的相對百分含量；按照上述GC/MS 測定條件對各飲片中提取得到的揮發(fā)油進(jìn)行化學(xué)成分分析。

對總離子流圖中的各峰經(jīng)過質(zhì)譜掃描后，通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)（NIST 和Willey 標(biāo)準(zhǔn)圖譜數(shù)據(jù)庫）檢索對照，并查閱有關(guān)質(zhì)譜資料，鑒定、計(jì)算出不同產(chǎn)地飲片中的揮發(fā)油的化學(xué)成分。見表2。

由表2 知，臨安於術(shù)、磐安白術(shù)、河北白術(shù)的飲片中的揮發(fā)油成分，經(jīng)GC/MS 檢測，共從中分離出38 個成分，鑒定出25 種成分（見表2），其中相對含量在1.0%以上的共11 種。3 批不同產(chǎn)地白術(shù)揮發(fā)油含量主要為烴類的不同，而醇類、酯類含量無顯著差異。揮發(fā)油主要成分蒼術(shù)酮，三者相差不多。

表2 各飲片中揮發(fā)油成分分析結(jié)果

2.2 白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量測定

2.2.1 HPLC 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)[4]Waters XBridge C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A：甲醇，流動相B：水，梯度洗脫（程序?yàn)椋?～40 min 60%～100% A）；檢測波長為230 nm（0～17 min）和276 nm（17～25 min）；柱溫：30℃；流速：1.0 mL·min-1；靈敏度0.2 AUFS。在上述色譜條件下，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ與白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ色譜峰與相鄰色譜峰分離度大于2.0，理論塔板數(shù)均大于6000。

2.2.2 對照品及供試品溶液的制備 對照品溶液：分別精密稱取白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ?qū)φ掌?.01 mg，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品3.98 mg，置50 mL 量瓶中，加甲醇至刻度。從中取1 mL 置10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，制成白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ與白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ濃度分別為0.006 02、0.007 96 mg·mL-1的混合溶液，作為對照品溶液。

供試品溶液：將樣品粉碎成細(xì)粉，稱取約1.0 g，精密稱定，置于錐形瓶中，加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理20 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 線性關(guān)系考察 精密依次吸取混合對照品溶液5、10、15、20、25 μL，按上述色譜條件進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量X（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值Y 為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ與白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的回歸方程，分別為：Y=5.52×106X+1.51×104，r=0.999 8；Y=2.00×106X+2.89×103，r=0.999 9。表明白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ與白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ分別在0.030 1～0.150 5 μg與0.039 8～0.199 0 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4 進(jìn)樣精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液10μL，按上述色譜條件進(jìn)樣測定，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定峰面積。白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ的峰面積分別為222 758、223 068、225 290、226 096、235 627、234 527，RSD 為2.51%；白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的峰面積分別為296 119、294 699、294 623、304 826、299 374、294 832，RSD 為1.36%，表明精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（批號211004）平行取樣6 份，每份約1.0 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液；分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液10 μL，按照上述色譜條件進(jìn)樣測定峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ與白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量的RSD 分別為0.75%和1.91%，表明重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（批號211004），分別于0、3、6、9、12、15 h 進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，結(jié)果白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ的峰面積分別為228 008、223 068、225 192、235 141、226 084、234 498，RSD 為2.20%。白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的的峰面積分別為294599、295324、294 522、298 313、304 927、294 134，RSD 為1.41%，表明供試品溶液在15 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6 份已知含量的同一批樣品（批號211004）0.5 g，分別加入白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品溶液適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液；分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液10 μL 注入液相色譜儀中，按照上述色譜條件測定峰面積，計(jì)算含量。白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ與白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的平均加樣回收率分別為98.6%和98.6%，RSD%分別為2.1%和1.8%。見表3、表4。

表3 白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ加樣回收率結(jié)果（n=6）

表4 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ加樣回收率結(jié)果（n=6）

2.2.8 含量測定結(jié)果 分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL 注入高效液相色譜儀中，按照上述色譜條件測定峰面積，計(jì)算各供試品溶液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ與白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量，結(jié)果見圖1，表5。

表5 樣品含量測定結(jié)果

圖1 高效液相色譜圖

結(jié)果表明，臨安於術(shù)及磐安白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ略高于河北白術(shù)，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量顯著高于河北。

2.2.9 聚類分析 24 批樣品主要分為兩類，將分析結(jié)果與產(chǎn)地信息結(jié)合發(fā)現(xiàn)：1～17 聚為一類，於術(shù)和磐安樣品；18～24 聚為一類，河北樣品；說明不同產(chǎn)地的白術(shù)內(nèi)酯顯示出一定地域差別。以含量測定分析，於術(shù)和磐安樣品的內(nèi)酯含量明顯高于河北的。見圖5。

圖5 24 批白術(shù)樣品內(nèi)酯聚類分析圖

3 討論

飲片中所含的揮發(fā)油總量和白術(shù)內(nèi)酯在不同產(chǎn)地有很大不同。揮發(fā)油總量（mL·g-1）檢測，臨安於術(shù)、磐安白術(shù)分別達(dá)1.9%、2.1%，而河北白術(shù)揮發(fā)油（mL·g-1）僅為0.6%，兩者比較相差懸殊。白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ與白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ總值臨安於術(shù)最高。有資料顯示[5]，於術(shù)由于具有土壤肥沃、亞熱帶氣候、降雨、光照、生態(tài)群落等環(huán)境，揮發(fā)油、白術(shù)內(nèi)酯成分的生成及累積要好于河北的白術(shù)。