抗栓膠囊中33 種禁用農藥的殘留量測定及風險評估*

程 妍，李 莉，張佳莉

常州市食品藥品纖維質量監督檢驗中心,常州 213000

抗栓膠囊是由當歸尾、壁虎、水蛭、馬錢子、甘草、骨碎樸、穿山甲、丹參、土鱉蟲、蜂房、人工麝香、土茯苓、烏梢蛇、僵蠶、蜈蚣、地龍、蟾酥、延胡索、虻蟲等19 味中藥組成，有活血化瘀、抗栓通脈的功效，用于血栓閉塞性脈管炎瘀血阻絡癥，對腦血栓、心肌梗塞、血栓性靜脈炎等亦有較好的輔助治療作用[1]。

由于野生資源的匱乏，需求量的增大，中藥材的人工種植成為必然趨勢。近年來，農藥的使用量呈現上升的趨勢，農藥殘留問題已引起國內外的普遍關注[2，3]。目前農藥殘留檢測的方法在不斷制定與完善中，對中藥材及成藥進行農藥殘留檢測與篩查也是勢在必行[4-6]。抗栓膠囊的制法為藥材原粉直接投料，在成藥中很可能會引入處方藥材中所帶入的農藥殘留，故有必要對中成藥中的農藥殘留量進行監測。本研究參考《中國藥典》2020 版四部2341 農藥殘留測定法第五法，采用GC-MS/MS 和LC-MS/MS 法對33 種禁用農藥殘留量進行考察。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

液相色譜質譜聯用儀（1290/6470A 安捷倫科技有限公司）；氣相色譜質譜聯用儀（7890B-7000D 安捷倫科技有限公司）；臺式高速冷凍離心機（賽默飛世爾科技有限公司）；分析天平（梅特勒托利多中國公司）。

1.2 藥品與試劑

對照品：33 種農藥混合標準品，購于中國食品藥品檢定研究院，批號為610020-202001，含量見表6。內標：磷酸三苯酯，來源于BuPure，批號為C0007247，含量為1000 μg·mL-1。乙腈、甲酸、乙酸甲酸銨為色譜純；水為超純水。樣品前處理使用的凈化材料購自Waters 公司，Waters DisQue，批號為186008079，其組成為：無水硫酸鎂900 mg，N-丙基乙二胺（PSA）450 mg，十八烷基硅烷鍵合硅膠300 mg，石墨化炭黑50 mg。29 批樣品信息見表1。

表1 29 批樣品信息

2 方法與結果

2.1 高效液相色譜與質譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 SB-C18（100 mm×2.1mm，2.7μm）；流動相A：0.1%甲酸溶液（含5mmol·L-1甲酸銨），流動相B：乙腈-0.1%甲酸溶液（含5mmol·L-1甲酸銨）（95∶5），梯度洗脫（程序為30%B 0～1min，100% B 12～14min，30% B 14.1～17min）；柱溫：40℃；流速：0.3 mL·min-1。

電噴霧（ESI）離子源，正離子掃描模式，監測模式為多反應監測（MRM）。毛細管電壓：4 kV；干燥氣溫度：250℃；干燥氣流速：8 L·min-1；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流速：11 L·min-1；霧化器壓力：310 kPa。各化合物監測離子對及質譜參數見表2。為了提高檢測靈敏度，根據保留時間分段監測各農藥。

表2 各農藥化合物的LC-MS/MS 離子對及質譜參數

2.2 氣相色譜與質譜條件

色譜柱：Agilent DB-17MS（柱長為30 mm，柱內徑為0.25 mm，膜厚度為0.25 μm）；進樣口溫度：250℃；不分流進樣；載氣：高純氦氣（He）；進樣口：恒壓模式；柱前壓力：146 kPa。按表3 進行程序升溫。

表3 檢測程序升溫

電子轟擊源（EI），正離子掃描模式，監測模式為多反應監測（MRM）。離子源溫度：250℃；碰撞氣：氮氣或氬氣；質譜傳輸接口溫度：250℃。各化合物監測離子對及質譜參數見表4。為了提高檢測靈敏度，根據保留時間分段監測各農藥。

表4 各農藥化合物的GC-MS/MS 離子對及質譜參數

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對照品儲備液 精密量取禁用農藥混合對照品溶液（已標示各相關農藥品種的濃度）1 mL，置20 mL 量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.2 氣相色譜-串聯質譜法所用內標溶液 取磷酸三苯酯對照品溶液1 mL，置100 mL 量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL 含10 μg 溶液，即得。精密量取上述溶液1 mL，置100 mL 量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL 含0.1 μg 內標溶液。

2.3.3 空白基質溶液 空白基質樣品為經檢測不含待測禁用農藥殘留的抗栓膠囊樣品。用溶劑配制混合對照品工作溶液作標準曲線，篩查不同廠家的樣品，最終選擇33 種農藥均未檢出的樣品（哈爾濱B 公司，批號201102，編號10）作為空白基質樣品。同供試品溶液的制備方法處理制成空白基質溶液。

2.3.4 基質混合對照品工作溶液 分別精密量取空白基質溶液1.0 mL（6 份），置氮吹儀上，40℃水浴濃縮至約0.5 mL，分別加入混合對照品儲備液10、20、50、100、200、500 μL，加乙腈稀釋至1 mL，渦旋混勻，即得。各化合物濃度信息見表5。

表5 各農藥化合物的標準儲備液及標準工作液濃度

2.3.5 供試品溶液 取供試品粉末（過3 號篩）3 g，精密稱定，置50 mL 聚苯乙烯具塞離心管中，加入1%乙酸溶液15 mL，渦旋使藥粉充分浸潤，放置30 min，加入乙腈15 mL，渦旋使混勻，置振蕩器上劇烈振蕩（500 r·min-1）5 min，加入無水硫酸鎂與無水乙酸鈉的混合粉末（4∶1）7.5 g，立即搖散，再置振蕩器上劇烈振蕩（500 r·min-1）3 min，于冰浴中冷卻10 min，離心（4000 r·min-1）5 min，取上清液9 mL，置預先裝有凈化材料的分散固相萃取凈化管（無水硫酸鎂900 mg，N-丙基乙二胺450 mg，十八烷基硅烷鍵合硅膠300 mg，石墨化碳黑50 mg）中，渦旋使充分混勻，置振蕩器上劇烈振蕩（500 r·min-1）5 min使凈化完全，離心（4000 r·min-1）5 min，取上清液，即得。

2.3.6 測定法 氣相色譜-串聯質譜法：分別精密吸取基質混合對照工作溶液、空白基質溶液和供試品溶液各1 mL，精密加入內標溶液0.3 mL，混勻，濾過，取續濾液，進樣1 μL。

高效液相色譜-串聯質譜法：分別精密吸取基質混合對照工作溶液、空白基質溶液和供試品溶液各1 mL，精密加入水0.3 mL，混勻，濾過，取續濾液，進樣1 μL。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性實驗 取“2.3.4” 項下標準曲線第3個濃度點的工作溶液作為對照品溶液。另取空白基質樣品適量，按“2.3.5”“2.3.6”項下方法，制成空白基質溶液。取空白基質溶液及對照品溶液，分別進樣，記錄色譜圖，見圖1、2。結果表明，空白基質對農藥殘留測定無干擾，專屬性良好。

圖1 空白基質溶液及對照品溶液LC-MS/MS 總離子流圖

2.4.2 線性關系考察 取“2.3.4”項下標準曲線溶液，按“2.1”“2.2”項下色譜與質譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各待測成分質量濃度（ng·mL-1）為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，各成分在各自濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系。以線性曲線第一濃度作為報告限，以《中國藥典》2020版四部禁用農藥檢出限度作為定量限。線性關系等見表6。

2.4.3 重復性試驗與加樣回收率試驗 取同一批33 種農藥均未檢出的樣品（哈爾濱B 公司，批號201102，編號10）約3 g，精密稱定，置50 mL 聚苯乙烯具塞離心管中，精密加入標準儲備液750 μL，揮干溶劑，按“2.3.5”“2.3.6”項下方法平行制備供試品溶液6 份，按“2.1”“2.2”項下色譜與質譜條件測定，測得加樣樣品中的含量，計算回收率，結果表明該方法的加樣回收率符合測定要求，見表6。

表6 線性關系、報告限、定量限、重復性與加樣回收率（n=6）

2.5 樣品含量測定

精密稱取不同廠家不同批號的抗栓膠囊，按“2.3.5”“2.3.6” 項下方法，制備成供試品溶液，按“2.1”“2.2”項下條件進樣測定，結果編號17 樣品檢出水胺硫磷0.027 μg·g-1，編號23 樣品檢出甲拌磷0.015 μg·g-1，編號1、13、14、20 樣品檢出氟蟲腈，分別為0.016、0.046、0.042、0.012 μg·g-1，編號19、20、27、28、29 檢出三氯殺螨醇0.139、0.124、0.083、0.083、0.064 μg·g-1，其余農藥組分均未檢出。

3 討論

3.1 檢測方法與色譜-質譜條件的選擇

本研究參考了《中國藥典》2020 版四部2341 農藥殘留測定法第五法，采用GC-MS/MS 和LC-MS/MS 法對33 種禁用農藥進行農藥殘留量的考察。前期在對藥典方法進行轉移驗證時考察了不同色譜柱的分離效果，結果選用Agilent Poroshell 120 SB-C18液相色譜柱和Agilent DB-17MS 氣相色譜柱。同時，對流動相比例與升溫梯度進行了微調，結果發現，藥典方法穩定可靠，基線平穩，保留時間合適，無基質干擾，適用于抗栓膠囊農殘檢測。

3.2 制備方法的選擇

本研究參考了《中國藥典》2020 版四部2341 農藥殘留測定法第五法，比較了多種制備方法。直接提取法雖較為簡便，但缺少凈化步驟，且抗栓膠囊有多達19 味藥材，只經過提取就進樣，干擾較大，污染較重。通過加樣回收率試驗，比較了快速樣品處理法（QuEChERS）及兩種固相萃取法，選用HLB固相萃取柱的固相萃取法，內吸磷回收率較低。選用氨基炭黑固相萃取柱的固相萃取法，內吸磷、蠅毒磷、甲磺隆、氯磺隆、胺苯磺隆回收率較低。而快速樣品處理法，所有農藥化合物回收率均符合《中國藥典》要求。因此本研究最終選擇快速樣品處理法作為供試品制備方法。

3.3 風險評估[7，8]

由于未有中藥材農藥殘留風險評估的指導原則出臺，故分別參照《食品中農藥殘留風險評估指南》和《中國藥典》2020 版四部9302“中藥有害殘留物限量制定指導原則” 建立農藥殘留風險評估模型。

3.3.1 參照 《食品中農藥殘留風險評估指南》 按公式1 計算最大允許濃度，ADI 為每日允許攝入量（mg·kg－1）。

圖2 空白基質溶液及對照品溶液GC-MS/MS 總離子流圖

根據抗栓膠囊說明書最大服用劑量為每日口服一次8 粒，一日3 次，每粒為0.3 g，日最大服用劑量為7.2 g 計算。

3.3.2 參照《中國藥典》2020 版四部 按公式2 計算：

L 為最大限量理論值（mg·kg－1）；A 為每日允許攝入量（mg·kg－1）；W 為人體平均體質量（kg），一般按63 kg 計；M 為每日人均可服用的最大劑量（kg），抗栓膠囊M 按日最大服用劑量為7.2 g；AT 為平均壽命天數，一般為365 天·年－1×70 年；EF 為中藥服用頻率（天·年－1），設為每年90 天；ED 為一生服用中藥的暴露年限，設為20 年；t 為農藥的轉移率（%），中成藥t 為100%；100 為安全因子，表示每日由中藥中攝取的農藥殘留量不大于日總暴露量（包括食物和飲用水）的1%。

表7 顯示，抗栓膠囊中殘留農藥水胺硫磷、甲拌磷、氟蟲腈和三氯殺螨醇含量極低，遠遠低于《中國藥典》2020 版四部和《食品中農藥殘留風險評估指南》規定的限度，可為廠家對產品進行農藥殘留風險評估提供方法參考。

表7 樣品農藥殘留風險評估結果

3.4 結果分析

由測定結果可知，部分批次抗栓膠囊樣品中檢出部分農藥殘留，包括1 批號水胺硫磷，1 批號甲拌磷，4 批號氟蟲腈，5 批號三氯殺螨醇，檢出率分別為3.4%、3.4%、13.8%、17.2%，其中2 批號氟蟲腈超出《中國藥典》2020 版四部禁用農藥檢出限度。

本研究參考了《中國藥典》2020 版四部2341 農藥殘留測定法第五法，采用GC-MS/MS 和LC-MS/MS 法對33 種禁用農藥進行農藥殘留量進行監測。結果顯示，該方法操作簡單、檢測快速、靈敏度高、重復性好，可用于抗栓膠囊的農藥殘留篩查。因LC-MS/MS 法檢測化合物靈敏度較高且不易有假陽性干擾，故同時可以用GC-MS/MS 和LC-MS/MS 檢測的化合物，以LC-MS/MS 檢測數據為主，必要時參考GC-MS/MS 數據。

本方含有19 味中藥，其中植物藥有當歸、丹參、馬錢子、甘草、茯苓、延胡索和骨碎樸。通過查詢相關文獻及相關報道，針對藥典規定的禁用農藥，依舊在某些中藥材中，會出現部分農藥易超標的情況。針對抗栓膠囊而言，其中當歸、丹參、甘草、延胡索均有檢出禁用農殘的報道。當歸有報道可能檢出甲拌磷、克百威、甲胺磷、氟蟲腈、涕滅威、滅線磷等；丹參有報道可能檢出總滴滴涕、硫丹、氟蟲腈等；甘草有報道可能檢出甲拌磷等；延胡索有報道可能檢出氟蟲腈等。中藥材農藥殘留超標問題較為嚴重，需要種植者及廠家嚴正關注，盡可能減少農殘超標的情況。