建立具有區(qū)分力溶出介質(zhì) 提升仿制藥非布司他的生物等效性

唐建飛，謝紅瑜，趙福斌，方 霞，郭艷超

杭州朱養(yǎng)心藥業(yè)有限公司，杭州 310018

一致性評(píng)價(jià)是指對(duì)已經(jīng)批準(zhǔn)上市的仿制藥，需在質(zhì)量、療效、安全性等方面達(dá)到與原研藥一致的水平，實(shí)現(xiàn)臨床上替代原研藥的目的[1]。開(kāi)展仿制藥一致性評(píng)價(jià)，有助于提高藥品的有效性和安全性，為臨床用藥提供更多選擇，也降低了患者治療費(fèi)用與節(jié)省國(guó)家醫(yī)保支出。

痛風(fēng)以及經(jīng)常發(fā)作痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、慢性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)病、痛風(fēng)性腎病和尿酸性結(jié)石病的長(zhǎng)期治療需使用降尿酸藥物，其主要作用途徑為抑制尿酸生成和促進(jìn)尿酸排泄。而抑制尿酸生成的常用藥物為別嘌醇和非布司他[2，3]。非布司他最先由日本Teijin Pharma研制開(kāi)發(fā)，于2008 年10 月被歐洲EMA 批準(zhǔn)上市，商品名為Adenuric?；2009 年2 月經(jīng)美國(guó)FDA 批準(zhǔn)上市，商品名為Uloric?[4]。2012 年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)在痛風(fēng)指南中將非布司他推薦為高尿酸血癥、痛風(fēng)的A 級(jí)治療藥物。

非布司他為選擇性高、效果顯著的黃嘌呤氧化酶抑制劑，通過(guò)作用于黃嘌呤氧化酶的鉬蝶呤中心，使氧化態(tài)或還原態(tài)的鉬輔因子保持孤立狀態(tài)，從而減少黃嘌呤氧化酶與底物的結(jié)合，減少尿酸的生成，降低血液中尿酸的濃度，從而達(dá)到治療高尿酸血癥或痛風(fēng)的作用。

本研究重點(diǎn)論述仿制藥非布司他片的開(kāi)發(fā)及生物等效性評(píng)價(jià)問(wèn)題。

1 儀器與藥品、試劑

儀器設(shè)備：708DS 全自動(dòng)溶出儀（安捷倫公司）；Angilent G6460 型三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（安捷倫公司）；XS205 萬(wàn)分之一天平（梅特勒公司）；pH計(jì)。

藥品：A 制劑非布司他片（風(fēng)定寧?，批號(hào)L190101，40 mg/片）、B 制劑非布司他片（風(fēng)定寧?，批號(hào)L190201，40 mg/片）、C 制劑非布司他片原研藥（Uloric?，批號(hào)A26679，40 mg/片）。

試劑：十二烷基硫酸鈉（SDS，含量99%，西格瑪公司，含量＞85%，西隴化工）、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、醋酸鈉、鹽酸均為分析純；純化水（自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 體外溶出試驗(yàn)

為確保仿制制劑與參比制劑的體外溶出對(duì)比方法準(zhǔn)確可靠，保證結(jié)果的可靠性，需要對(duì)溶出曲線檢測(cè)方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

選擇驗(yàn)證的介質(zhì)4 種：0.5%SDS 溶液、pH 1.2（含0.5% SDS）、pH 4.5（含0.5% SDS）和pH 6.8 磷酸鹽緩沖液。驗(yàn)證項(xiàng)目包括專屬性、濾膜吸附、溶液穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度、精密度、線性與范圍。驗(yàn)證結(jié)果：專屬性良好，空白輔料和空白溶劑對(duì)檢測(cè)無(wú)影響；濾膜吸附試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)棄去4 mL 初濾液時(shí)達(dá)到吸附飽和；對(duì)照品溶液和供試品溶液在室溫條件下6 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好；在0.5% SDS 介質(zhì)中平均回收率為100.3%，在pH 1.2 的0.5% SDS 中平均回收率為97.2%，pH 4.5 的0.5% SDS 平均回收率為98.8%；在pH 6.8 磷酸鹽緩沖液中的平均回收率為99.7%；在4 種介質(zhì)中回收率良好；重復(fù)性和中間精密度的結(jié)果RSD 均＜2%；線性在標(biāo)示量的10%～120%濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均＞0.999 9。

2.1.1 具有區(qū)分力的介質(zhì)篩選

2.1.1.1 非布司他在不同介質(zhì)中飽和溶解度 依照緩沖液配制方法（《中國(guó)藥典》2020 年版四部通則8004），配制pH 1.0、pH 2.2 鹽酸溶液，pH 3.8、pH 4.5醋酸鹽緩沖液，pH 5.5、pH 6.0、pH 6.8、pH 7.6 磷酸鹽緩沖液，以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.30%、0.35%、0.40%、0.45%、0.50%的十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液，取本品在上述介質(zhì)中進(jìn)行飽和溶解度試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 非布司他在不同pH 條件下的溶解度

由表1 可知，本品具有pH 值依賴性，這與日本IF 文件數(shù)值一致[5]；隨著SDS 濃度增加，非布司他溶解度增加，因不同廠家的SDS 純度不同，pH 值會(huì)有差異。本次研究使用的SDS 采用西格瑪品牌，純度大于99%，減少了其純度對(duì)結(jié)果的影響。根據(jù)原料在不同濃度SDS 中的溶解度，將進(jìn)一步考察原研制劑在不同濃度pH 值介質(zhì)中的溶出曲線。

2.1.1.2 原研制劑在不同pH 值介質(zhì)中的溶出曲線 對(duì)同一批原研樣品在不同pH 值介質(zhì)中進(jìn)行曲線考察，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 原研品不同pH 值介質(zhì)中溶出曲線

從曲線圖中可知，制劑在pH 1.2 和pH 4.5 介質(zhì)中溶出緩慢，在pH 6.8 和pH 6.0 介質(zhì)中溶出較快，均無(wú)法達(dá)到仿制品與原研品有效對(duì)比的目的；在pH 5.5 介質(zhì)中溶出適中，但考慮到本品對(duì)pH 值依賴性明顯，對(duì)溶出介質(zhì)的配制誤差接受度較低，故從不同濃度SDS 水溶液中對(duì)原研品溶出曲線的影響進(jìn)行篩選。

2.1.1.3 原研制劑在不同濃度SDS 介質(zhì)中的溶出曲線 在不同pH 值緩沖液中加入SDS 不會(huì)影響pH值，多次配制的介質(zhì)pH 結(jié)果見(jiàn)表2；不同品牌的SDS 水溶液的pH 值差異較大，但將純度較大的同品牌SDS 將不同時(shí)間配制并加入不同濃度的SDS水溶液時(shí)，pH 值未見(jiàn)明顯差異。SDS 水溶液其pH值結(jié)果見(jiàn)表3；本次研究選擇純度較高的SDS（西格瑪）水溶液進(jìn)行曲線條件篩選，結(jié)果見(jiàn)圖2。

表2 不同pH 介質(zhì)中加入不同濃度SDS 的pH 值測(cè)定結(jié)果

表3 不同濃度SDS 水溶液的pH 值測(cè)定結(jié)果

從圖2 曲線可知，0.3% SDS 溶出曲線較低，不利于觀察仿制品與原研品溶出曲線是否一致，故初步選擇0.5% SDS 作為關(guān)鍵介質(zhì)。

圖2 原研品不同濃度SDS 介質(zhì)中溶出度曲線

2.1.1.4 區(qū)分不同工藝樣品溶出介質(zhì)的篩選 取處方組成一致、工藝中采用不同工藝參數(shù)制備2 個(gè)制劑，用A 和B 表示。

A 制劑制粒攪拌速度為360 r·min-1，B 制劑制粒攪拌速度為180 r·min-1。取兩種制劑各12 片，依照溶出度與釋放度測(cè)定法（《中國(guó)藥典》2020 年版四部通則0931 第二法），分別以pH 1.2 的0.5% SDS、pH 4.5 的0.5% SDS、pH 6.8 磷酸鹽緩沖液和0.5%SDS 水溶液各900 mL 作為溶出介質(zhì)，設(shè)置溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為75 r·min-1，于5、10、15、30、45、60 min 自動(dòng)取樣5 mL，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液2 mL，置10 mL量瓶中，加溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，即為供試品溶液。

精密稱取非布司他對(duì)照品10 mg，置25 mL 量瓶中，加乙腈-水（1∶1）適量，超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密移取1 mL 置50 mL 量瓶中，用溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

取上述供試品溶液和對(duì)照品溶液，按照紫外-可見(jiàn)分光光度法（《中國(guó)藥典》2020 年版四部通則0401），于315 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算不同條件下非布司他累積溶出度，結(jié)果見(jiàn)圖3～圖6。

圖3 A 制劑和B 制劑在pH 1.2 的0.5% SDS 介質(zhì)中曲線比較

圖4 A 制劑和B 制劑在pH 4.5 的0.5% SDS 介質(zhì)中曲線比較

圖5 A 制劑和B 制劑在pH 6.8 磷酸鹽溶液中的曲線比較

圖6 A 制劑和B 制劑在0.5%SDS 介質(zhì)中曲線比較

差異因子f1是衡量?jī)蓷l曲線相對(duì)偏差的參數(shù)，f1越大，說(shuō)明兩條溶出曲線的差異越顯著。因此，可以通過(guò)差異因子（f1）法計(jì)算圖3～6 中兩條溶出曲線的總體差異，計(jì)算公式如下：

其中n 為取樣時(shí)間點(diǎn)個(gè)數(shù)，Rt為A 制劑在t 時(shí)刻的累積溶出百分率，Tt為B 制劑在t 時(shí)刻的累積溶出百分率，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 A 制劑和B 制劑在不同介質(zhì)中差異因子f1

從圖7 可知3 批原研品在0.5% SDS 介質(zhì)中無(wú)明顯差異；但從圖6 和表2 可知，不同工藝的仿制品在0.5% SDS 水溶液中溶出具有一定的差異性，故選擇0.5% SDS 作為關(guān)鍵介質(zhì)，篩選處方工藝。

圖7 不同批次原研品在0.5% SDS 介質(zhì)中溶出曲線

2.1.2 自制片與原研[1]片溶出比較 以“2.1.1.4”方法，測(cè)定仿制片A、B 與原研制劑C 在0.5% SDS 介質(zhì)中溶出曲線，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 仿制片與原研片在0.5% SDS 介質(zhì)中藥物釋放曲線比較

相似因子f2是衡量?jī)蓷l曲線相似程度的參數(shù)，f2越大說(shuō)明兩條曲線相似性越高。從表5 可知，A 制劑和原研制劑的相似因子f2小于50，而B(niǎo) 制劑相似因子遠(yuǎn)大于50，說(shuō)明B 制劑和原研制劑曲線相似性較高，在體內(nèi)更易達(dá)到生物等效。

2.2 體內(nèi)試驗(yàn)

采用仿制片A 和B 及原研制劑C1 進(jìn)行體內(nèi)生物等效性試驗(yàn)。

試驗(yàn)單位：海口市人民醫(yī)院，

倫理審核單位：海口市人民醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)

2.2.1 受試者選擇 根據(jù)臨床研究方案，招募24位健康受試者，男女比例適宜，將受試者隨機(jī)均分為兩個(gè)試驗(yàn)組（T1 組和T2 組）。所有入組的受試者均符合試驗(yàn)方案的入選標(biāo)準(zhǔn)。

2.2.2 分組給藥與血樣本采集 本試驗(yàn)采用隨機(jī)、開(kāi)放、兩周期、自身交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，洗脫期為7 天。將24 位健康受試者按1∶1 隨機(jī)分為T1、T2 試驗(yàn)組，兩組男女比例相同。

T1 試驗(yàn)組：將12 位受試者按1∶1 隨機(jī)分TR、RT 兩個(gè)給藥組：第一周期給藥當(dāng)天按藥物隨機(jī)表，12 位受試者用240 mL 溫水送服1 片參比制劑（R、商品名：Uloric?，40 mg/片）或1 片受試制劑A（TA、40 mg/片）。洗脫期7 天，第二周期按藥物隨機(jī)表，12位受試者服用對(duì)應(yīng)的T 或R 制劑。

T2 試驗(yàn)組：將12 位受試者按1:1 隨機(jī)分TR、RT兩個(gè)給藥組：第一周期給藥當(dāng)天按藥物隨機(jī)表，12 例受試者用240 mL 溫水送服1 片參比制劑（R、商品名：Uloric?，40 mg/片）或1 片受試制劑B（T、40 mg/片）。洗脫期7 天，第二周期按藥物隨機(jī)表，12 位受試者服用對(duì)應(yīng)的T 或R 制劑。

餐后試驗(yàn)每周期，分別在給藥前（0 h）及給藥后0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.5、3、3.5、4、5、6、8、12、24h 共18 個(gè)采血點(diǎn)，每次采集受試者上肢靜脈血約4mL。采集后的全血置于冰浴的EDTA-K2 采血管中，進(jìn)行離心處理（2℃～8℃、2000g、10min），離心結(jié)束后獲得血漿，將血漿分裝置于檢測(cè)管及備份管中（每管血漿不少于0.8mL）。分裝結(jié)束后，將檢測(cè)管及備份管存放于超低溫冰箱（≤-60℃）中保存待測(cè)。

2.2.3 血藥濃度測(cè)定及安全性

2.2.3.1 血藥濃度測(cè)定 采用LC-MS/MS 法，將EDTA-K2 抗凝的血漿樣品作蛋白沉淀提取后，取上清液加50%乙腈-水稀釋進(jìn)樣，以非布司他-d7 為內(nèi)標(biāo)，檢測(cè)人血漿中非布司他濃度。

液相色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相（Angilent Poroshell 120EC-C183.0 mm×50 mm，2.7 μm），0.1%甲酸水溶液-乙腈（20∶80）為流動(dòng)相，柱溫25℃，流速0.4 mL·min-1，進(jìn)樣量5 μL，運(yùn)行時(shí)間5 min。

質(zhì)譜條件：采用ESI 源，正離子MRM 模式檢測(cè)。

對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行了驗(yàn)證，內(nèi)容包括系統(tǒng)適用性、線性與范圍、精密度、準(zhǔn)確度、提取回收率和穩(wěn)定性等。驗(yàn)證結(jié)果：系統(tǒng)適用性良好，5 次重復(fù)分析所得待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)色譜峰面積比值的變異系數(shù)小于10%；非布司他標(biāo)準(zhǔn)曲線在5～4000 ng·mL-1范圍內(nèi)r2＞0.999 9，線性良好；批內(nèi)和批間精密度的變異系數(shù)均小于10%，說(shuō)明精密度良好；定量下限（LLOQ）濃度、低濃度、中濃度、高濃度的準(zhǔn)確度均在90%～110%，說(shuō)明準(zhǔn)確度良好；待測(cè)物提取回收率范圍為94.7%～96.5%，變異系數(shù)為0.9%，內(nèi)標(biāo)物的提取回收率97.6%，變異系數(shù)為1.2%，說(shuō)明待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物提取回收率均良好；非布司他全血樣品在冰水浴中可穩(wěn)定5 h，血漿樣品至少4 個(gè)凍融循環(huán)（-60℃）穩(wěn)定，制備后樣品在6℃環(huán)境中存儲(chǔ)70h 穩(wěn)定，樣品處理液6℃條件可保存61h 后再進(jìn)樣，生物樣本在-60℃及-20℃條件下可長(zhǎng)期存放38 d。結(jié)論：經(jīng)驗(yàn)證本方法可用于測(cè)定人血漿中的非布司他濃度。

2.2.3.2 安全性狀況 采用非房室模型（NCA）計(jì)算非布司他的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，觀察所有受試者在臨床研究期間發(fā)生的任何不良事件，對(duì)不良事件發(fā)生率、不良事件與試驗(yàn)藥物相關(guān)性分析及嚴(yán)重程度分析等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。在本次研究過(guò)程中，無(wú)嚴(yán)重不良事件發(fā)生，試驗(yàn)過(guò)程中無(wú)受試者死亡報(bào)告。

2.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 分析血藥濃度（c）-時(shí)間（t）、PK 參數(shù)，采用BE 集，將主要藥代參數(shù)Cmax、AUC0-t、AUC0-∞對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析（ANOVA），計(jì)算兩藥主要藥代參數(shù)的幾何平均值比值的90%置信區(qū)間。比較試驗(yàn)制劑與參比制劑活性成分的主要藥代參數(shù)，當(dāng)受試制劑與參比制劑Cmax、AUC0-t和AUC0-∞最小二乘幾何均值比值的90%置信區(qū)間在80.0%～125.0%等效范圍內(nèi)，則判斷為兩制劑生物等效。

2.2.5 體內(nèi)生物等效性分析

2.2.5.1 餐后血藥濃度（c）-時(shí)間（t）曲線 A 組受試者口服參比制劑（Reference，R）和受試制劑（Test，TA）后血藥濃度（c）-時(shí)間（t）曲線，見(jiàn)圖8。B 組受試者口服參比制劑（Reference，R）和受試制劑（Test，TB）血藥濃度（c）-時(shí)間（t）曲線，見(jiàn)圖9。

圖8 A 組受試者餐后平均血藥濃度-時(shí)間曲線

圖9 B 組受試者餐后平均血藥濃度-時(shí)間曲線

2.2.5.2 餐后藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) A 組受試者口服非布司他片受試制劑和原研藥的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表6、生物等效性評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表7。B 組受試者口服非布司他片受試制劑和原研藥：其主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表8、生物等效性評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表9。

表6 A 制劑藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)列表（PKPS）

表7 A 制劑生物等效性評(píng)價(jià)結(jié)果（BES）

表8 B 制劑藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)列表（PKPS）

表9 B 制劑生物等效性評(píng)價(jià)結(jié)果（BES）

2.2.6 生物等效性評(píng)價(jià) 經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后雙單側(cè)t檢驗(yàn)結(jié)果表明，A 制劑和原研品非布司他片在餐后條件下Cmax90%置信區(qū)間為76.9%～100.0%，AUC0-t90%置信區(qū)間為101.5%～105.2%，AUC0-∞90%置信區(qū)間為101.5%～105.2%；Cmax未落在80.0%～125.0%等效范圍內(nèi)。A 制劑和原研品非布司他片不具有生物等效性。

經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后雙單側(cè)t 檢驗(yàn)結(jié)果表明，B 制劑和原研品非布司他片在餐后條件下Cmax90%置信區(qū)間為95.8%～122.2%，AUC0-t90%置信區(qū)間為99.5%～106.7%，AUC0-∞90%置信區(qū)間為98.9%～106.0%；均落在80.0%～125.0%等效范圍內(nèi)。B 制劑和原研品非布司他片具有生物等效性。

綜上所述，在所選溶出介質(zhì)+0.5% SDS，75 r·min-1條件下，當(dāng)A 制劑f2=47（f2＜50 溶出行為不一致）時(shí)，表現(xiàn)出與原研品體內(nèi)餐后Cmax不等效，其他指標(biāo)均等效；當(dāng)B 制劑f2=70（f2＞50 溶出行為一致）時(shí)，表現(xiàn)出與原研品體內(nèi)餐后Cmax、AUC0-t、AUC0-∞均等效。

3 討論

對(duì)于生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)Ⅱ類（BCS Ⅱ）藥物，溶出過(guò)程是口服吸收的限速步驟，像非布司他這種難溶且有pH 依賴的BCSII 類品種，在仿制藥開(kāi)發(fā)中，達(dá)到與原研品體內(nèi)生物等效難度較高。本研究建立了體內(nèi)外相關(guān)的溶出曲線方法，對(duì)指導(dǎo)工藝開(kāi)發(fā)，降低體內(nèi)不等效的風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。

本研究選擇關(guān)鍵工藝參數(shù)為變量，制備不同的樣品，以0.5% SDS 水溶液為介質(zhì)進(jìn)行溶出行為比較，發(fā)現(xiàn)A 制劑溶出曲線30 min 前較明顯低于原研品，相似因子f2為47，體內(nèi)餐后Cmax為76.9%～100.0%，下限略低于80.0%，為不等效；B 制劑溶出曲線與原研品非常接近，f2為70，體內(nèi)餐后Cmax為95.8%～122.2%，為等效。從兩組體內(nèi)外相關(guān)數(shù)據(jù)可知，本研究中的溶出介質(zhì)可有效區(qū)分非布司他片的內(nèi)在質(zhì)量，并可通過(guò)體外溶出行為預(yù)測(cè)其體內(nèi)吸收情況，具有一定的體內(nèi)外相關(guān)性。本研究表明，確保該介質(zhì)中仿制品與原研品溶出曲線比較f2大于50，可提高體內(nèi)生物等效性的通過(guò)率。