基于非靶向代謝組學的促乳腺癌曲妥珠單抗耐藥代謝產物分析*

董春濤，魏棒棒，曹懌瑋，張文鈞，許飛飛，司鑫鑫**

1江蘇海洋大學藥學院 江蘇省海洋藥物活性分子篩選重點實驗室，連云港 222005；2 南京醫科大學 藥學院，南京 211166

乳腺癌可依據分子分型分為管腔A 型、管腔B型、人類表皮生長因子受體2（HER2）陽性型和基底樣型4 個亞型[1]。在乳腺癌患者中約有20%被診斷為HER2 陽性乳腺癌，因其預后差，復發率高，嚴重威脅到女性的生命安全。

目前，在臨床上主要采用曲妥珠單抗（trastuzumab）聯合化療藥物治療HER2 陽性乳腺癌，但隨著曲妥珠單抗的廣泛應用，耐藥問題日益突出。由于耐藥診斷的滯后性，造成了曲妥珠單抗耐藥患者不能得到及時的診斷，使患者錯過最佳治療窗，生存期降低。因此臨床亟需耐藥的預測指標以及逆轉耐藥的有效治療方法。

非靶向代謝組學（untargeted metabolomics）是對整個代謝組進行系統地分析，從樣本中獲取物質分子及離子碎片信息，鑒定和識別大量代謝物，以發現用于疾病診斷的新型生物標志物[2]。目前，利用超高效液相色譜-串聯質譜（UHPLC-MS/MS）非靶向代謝組學方法探究曲妥珠單抗耐藥的報道很少。本研究選擇SK-BR-3 和HCC1954 兩株HER2 陽性乳腺癌細胞進行研究。

SK-BR-3 細胞是從女性乳腺癌患者胸腔積液中分離出來，HER2 蛋白過度表達，并對曲妥珠單抗敏感[3]，HCC1954 細胞源自原發性ⅡA 期，3 級浸潤性導管癌，HER2 蛋白過度表達，對曲妥珠單抗耐藥[4]。上述兩株細胞之間的差異篩選已被廣為認可，已有研究從SK-BR-3 和HCC1954 細胞中篩選差異基因，用于曲妥珠單抗耐藥診斷生物標志物的研究[5]。因此，本研究通過檢測兩株細胞之間代謝物含量變化，篩選差異代謝物，用于曲妥珠單抗耐藥診斷的后續研究。

現采用了主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA）、層次聚類分析、相關性分析以及KEGG 通路富集分析，篩選出差異代謝物，為臨床開發新的曲妥珠單抗耐藥標志物和治療靶點奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料與試劑

1.1.1 儀器 Dionex UltiMate 3000 液相色譜儀和Q ExactiveTM組合型四極桿OrbitrapTM質譜儀（美國賽默飛公司）；CKX41 生物顯微鏡（日本奧林巴斯）；真空離心濃縮儀（美國Labconco 公司）；十萬分之一AUW220D 電子天平（日本島津公司）；Allegra 64R臺式高速冷凍離心機（美國貝爾曼庫爾特公司）。

1.1.2 材料與試劑 McCoy’s 5A Medium 培養基粉末、對乙酰氨基酚、乙腈、甲醇和甲酸購自美國Sigma 公司；胎牛血清（FBS）和RPMI 1640 培養基粉末均購自美國Gibco 公司；HER2 陽性SK-BR-3和HCC1954 乳腺癌細胞，系購自美國模式培養物集存庫（ATCC）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 HER2 陽性乳腺癌曲妥珠單抗敏感細胞SK-BR-3，用含15%胎牛血清（FBS）和1%青霉素與鏈霉素的McCoy’s 5A Medium 培養基中培養。HER2 陽性乳腺癌曲妥珠單抗耐藥細胞HCC1954 細胞，在含10% FBS 和1%青霉素與鏈霉素RPMI 1640 中的培養基中培養。SK-BR-3 和HCC1954 細胞均在37℃、5%CO2的環境中培養，細胞每兩天換液一次，5～7 天需要傳代一次，使用0.25%胰蛋白酶消化貼壁細胞使其懸浮，加入到含有新培養基的培養皿中，兩株細胞系均培養5 皿，提取細胞代謝物。

1.2.2 細胞代謝物提取與樣本制備 在細胞培養皿中加入1.5 mL 的超純水，放置2 h 于-80℃冰箱內，以甲醇配制的1 μg·mL-1對乙酰氨基酚4.5 mL于培養皿中，用細胞刮刀輕輕刮下細胞，吸取細胞裂解液。再次加入預冷的75%甲醇水2 mL 于培養皿中，將兩次的細胞裂解液進行合并，渦旋離心，取上清液，4℃旋轉蒸發，用80%甲醇水復溶樣品。在每個樣本中各吸取10 μL 復溶后的溶液，制成質量控制（QC）樣本，用來判斷儀器穩定性與數據可靠性。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：00D-4725-AN Kinetex EVO C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流動相A 為0.1%甲酸水溶液，流動相B 為0.1%甲酸乙腈溶液[線性梯度：B 10%（0 min）→30%（1 min）→95%（19 min）→95%（20 min）→10%（20.1 min）→10%（23 min）]；柱溫：40℃；流速：0.4 mL·min-1；進樣量：5 μL。

1.2.4 質譜條件 Q ExactiveTM組合型四極桿OrbitrapTM質譜儀，分別采用電噴霧電離（ESI）正離子與負離子兩種模式檢測。ESI 源條件如下：毛細管溫度：300℃，噴霧電壓：±3.5 kV；質荷比（m/z）67～1000為一級質量掃描范圍,二級碰撞能（30±15）eV，二級質量掃描范圍m/z 為30～1000。

1.2.5 數據處理 采用MS-Covert 軟件將原始數據格式轉化為mzML 格式，利用MS-DIAL 軟件對非靶向代謝組學數據進行程序化處理。將采集到的數據進行峰提取、解卷積、峰對齊和化合物的識別，得到化合物的峰值列表。列表中包含峰強度、峰面積、質荷比、保留時間與化合物離子碎片等重要信息[6]。

1.2.6 數據分析 數據分析包括統計學分析和生物信息學分析。主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）通過SIMCA-P（v14.0）軟件完成。在分析過中需要判斷模型的擬合程度。在回歸分析中，通常用R2判斷模型擬合性的效果，用Q2表征模型的預測能力，當R2和Q2越接近1 時，模型的穩定性和預測能力越好[7]。利用OPLS-DA 分析中獲得變量重要性投影（VIP）值與差異倍數（FC）和P值進行差異代謝物的篩選，以VIP ＞1、P ＜0.05、FC ＞1.5 或FC ＜0.67 作為代謝物顯著上調或下調的篩選標準[8]。代謝物鑒定是通過檢索人類代謝組數據庫（HMDB）和MassBank 數據庫對分子離子峰和二級碎片進行預測，以及通過標準品進行驗證。生物信息學分析主要包括層次聚類分析、相關性分析和KEGG 通路富集分析。通過層次聚類分析可以直觀地體現代謝物間和樣本間的關系；相關性研究可以觀察代謝物之間的表達模式的異同；通路富集分析可對差異表達代謝物進行功能注釋。

2 結果

2.1 耐藥和敏感細胞代謝組分析

2.1.1 PCA 分析結果 通過PCA 分析，發現在正負離子兩種模式下R2x均為0.707，表明了模型的擬合性較好。QC 樣本聚集明顯，表明儀器穩定性較好，實驗數據結果穩定可靠。曲妥珠單抗耐藥細胞和曲妥珠單抗敏感細胞之間分離趨勢較為明顯，說明組間具有顯著性差異。PCA 得分圖如圖1 所示。

圖1 曲妥珠單抗敏感細胞（SK-BR-3）和耐藥細胞（HCC1954）在ESI 正離子（1A）和負離子（1B）PCA 得分圖

2.1.2 OPLS-DA 分析結果 OPLS-DA 可以將與分類無關的信息過濾，從而能夠準確分析兩組樣本之間的差異性。ESI 正離子模式下：R2x=0.765，R2y=0.993，Q2y=0.945，ESI 負離子模式下R2x=0.631，R2y=0.982，Q2y=0.933，表明模型擬合性較好，模型預測能力較強。兩組樣本之間的分離程度較為明顯，兩組細胞間代謝物有顯著性差異，如圖2 所示。

圖2 曲妥珠單抗敏感細胞（SK-BR-3）和耐藥細胞（HCC1954）在ESI 正離子（2A）和負離子（2B）OPLS-DA 圖

2.2 差異代謝物鑒定與分析

2.2.1 差異代謝物鑒定 如圖3 火山圖所示，在正負離子模式下共得到3439 個代謝峰。以VIP>1、P<0.05、FC>1.5 或FC<0.67 作為代謝物顯著上調或下調的篩選標準，得到383 個顯著差異代謝峰，依據MS-DIAL 數據庫分析對這些代謝峰的注釋，篩選出15 個具有顯著差異的內源性代謝物，為了進一步驗證數據的準確性，利用HMDB 和MassBank數據庫對上述代謝物進行鑒定，將實驗所得分離離子峰和特征碎片離子峰與數據庫進行匹配，結果發現與數據庫一致。

圖3 差異代謝峰火山圖分布

另外對正亮氨酸、谷胱甘肽、谷氨酸、谷氨酰胺和色氨酸進行了標準品驗證，分子離子峰和碎片離子峰均能與實驗結果相一致，代謝物鑒定與篩選結果如表1 所示。然后對15 個差異代謝物進行分類，其中氨基酸及其衍生物5 種，脂肪酸類3 種、肉堿類3 種，葡萄糖類衍生物2 種，核苷酸類和磷脂類各1 種。

表1 差異代謝物信息

2.2.2 層次聚類分析 通過對代謝物進行層析聚類分析，更直觀地觀察各個樣本之間的關聯性。熱圖結果顯示，谷氨酰胺、丙酰肉堿、正亮氨酸、谷胱甘肽、L-谷氨酸、色氨酸和L-肉堿在耐藥細胞株中顯著上調，其中曲妥珠單抗耐藥組的豐度明顯高于敏感組的代謝物，大部分為氨基酸及其衍生物。在耐藥細胞中，6-磷酸葡萄糖酸、磷酰乙醇胺、D-葡萄糖酸、棕櫚酸、硬脂酸、棕櫚酰肉堿、次黃嘌呤和肉豆蔻酸下調，如圖4 所示。

2.2.3 相關性分析 通過相關性分析可以幫助揭示代謝物之間的關聯性。相關性結果顯示，棕櫚酸與肉豆蔻酸的變化趨勢相同，呈正相關，相關性較強。丙酰肉堿與谷氨酰胺和L-肉堿的變化趨勢差異較大，呈負相關；L-肉堿與肉豆蔻酸和硬脂酸呈負相關。相關性分析如圖5 所示。

圖5 相關性分析

2.2.4 差異代謝物的KEGG 富集通路分析 通路富集分析的氣泡圖如圖6 所示，結果發現，有9 條代謝通路顯著富集（P<0.05），其中氮代謝和谷氨酰胺與谷氨酸代謝通路最為顯著，P 值為0.001 3。代謝通路信息如表2 所示。

表2 代謝通路信息統計

圖6 通路富集分析

在9 條代謝通路中映射出的代謝物包括硬脂酸、色氨酸、谷氨酰胺、L-谷氨酸、谷胱甘肽、L-葡萄糖酸、棕櫚酸和6-磷酸葡萄糖酸，其中谷氨酸和谷氨酰胺在多條代謝通路中被發現。

3 討論

本研究基于非靶向代謝組學技術，以VIP>1、P<0.05、FC>1.5 或FC<0.67 作為代謝物上調或下調的篩選標準。在曲妥珠單抗敏感和耐藥的乳腺癌細胞中篩選出15 個顯著差異的代謝物，其中上調代謝物7 個，下調代謝物8 個。通過通路富集分析發現了氮代謝、谷氨酰胺與谷氨酸代謝和不飽和脂肪酸生物合成等9 條被顯著富集的代謝通路，其中氮代謝、谷氨酰胺與谷氨酸代謝通路最為顯著，并且在這兩條代謝通路中都發現了谷氨酰胺和谷氨酸。因此，在代謝通路中，谷氨酰胺和谷氨酸的改變可能與腫瘤的發生、發展和耐藥有關。

氮代謝在生物體內發揮著重要作用，氮是各種生物分子合成的必需物質，可以為細胞生長提供所需的核苷酸、己糖胺等物質[9]。腫瘤細胞增殖攝入大量核苷酸以維持細胞生長，研究發現，谷氨酰胺轉運體SLC1A5 在腫瘤細胞中增加，加快了谷氨酰胺的轉運，進而加速了氮代謝過程，為腫瘤細胞提供自身和合成所需的物質[10]。有研究對氮代謝通路中核糖焦磷酸氨基轉移酶（PPAT）進行探索，發現磷酸核糖PPAT 的表達在肺腺癌中顯著增加，對谷氨酰胺的氮轉移做出了重大貢獻，且與患者的疾病預后有關[11]。在氮代謝過程中，細胞內谷氨酸在谷氨酰胺合成酶作用下可以合成谷氨酰胺，有研究表明，通過谷氨酰胺合成酶作用產生的谷氨酰胺對于核苷酸生物合成在惡性膠質瘤等癌癥中尤其重要[12]。

谷氨酰胺與谷氨酸代謝通路可以通過消耗谷氨酰胺和谷氨酸為三羧酸循環提供碳源，從而進一步支持腫瘤細胞的快速增殖[13]。細胞內的谷氨酰胺通過谷氨酰胺酶（GLS1）作用轉化為谷氨酸，通過谷氨酸進一步生成α-酮戊二酸，為檸檬酸和脂肪酸的生物合成的三羧酸循環提供碳源[14]。有研究發現，腫瘤細胞對谷氨酰胺的分解具有依賴性，在谷氨酰胺代謝通路中，Wise DR 等[15]研究發現，谷氨酰胺被GLS1 分解得到的α-酮戊二酸參與三羧酸循環，為腫瘤細胞提供能量，維持腫瘤細胞的生長。有研究報道，在ER 陰性的乳腺癌中發現GLS1 過度表達，與腫瘤預后不良明顯相關[16]。Zhao Y 等[17]研究了5-氟尿嘧啶可以增強GLS1 抑制，增加對直腸癌的抗腫瘤活性。

此外，既往研究也表明，谷胱甘肽代謝和磷酸戊糖代謝通路與多種惡性腫瘤的發生發展及耐藥密切相關。在腫瘤細胞中需要谷胱甘肽代謝產生大量谷胱甘肽與活性氧維持平衡，減少活性氧對腫瘤細胞的損傷[18]。磷酸戊糖代謝通路不僅可以產生磷酸戊糖和核糖核苷，還可以為腫瘤細胞提供能量，并在細胞氧化還原穩態中起關鍵作用[19]。因此，在HER2 陽性乳腺癌曲妥珠單抗耐藥細胞代謝通路中，蛋白或酶的改變可能與發生耐藥有關。

在代謝通路中，代謝酶活性增強或減弱可能直接導致了下游代謝物發生改變。通過對曲妥珠單抗耐藥細胞下游代謝物含量檢測，可尋找用于曲妥珠單抗耐藥診斷的標志物。本研究中發現谷氨酰胺和谷氨酸在多條代謝通路中發揮作用，尤其是在氮代謝和谷氨酰胺與谷氨酸代謝通路中，不僅為腫瘤細胞提供生長所需的核苷酸等必需物質，還為腫瘤細胞提供能量以支持其快速生長。因此，谷氨酰胺和谷氨酸的含量在代謝通路中發生改變可能與多種惡性腫瘤的發生發展以及耐藥密切相關。既往研究表明，谷氨酰胺攝取量增加與腎細胞癌舒尼替尼的耐藥有關[20]。在轉移性去勢抵抗性前列腺癌患者血漿中，較高的谷氨酰胺與不良預后有關，可以作為預后標志物對耐藥患者進行診斷[21]。乳腺癌對阿霉素耐藥的細胞中谷氨酸高度表達，并與乳腺癌的惡性程度有關[22]。在轉移性食管鱗狀細胞癌患者血清中，檢測到谷氨酸水平較非轉移性食管鱗狀細胞癌明顯上升，與惡性腫瘤預后不良有關，是診斷轉移性食管鱗狀細胞癌的重要血清標志物[23]。因此，谷氨酰胺和谷氨酸可能作為標志物用于HER2 陽性乳腺癌曲妥珠單抗耐藥的診斷。

在HER2 陽性乳腺癌曲妥珠單抗耐藥細胞中檢測到的谷胱甘肽、色氨酸和次黃嘌呤還可能與腫瘤的發生發展及耐藥有關。有研究表明，谷胱甘肽在對順鉑耐藥的肺癌腦轉移患者中高度表達，與標志物GPX4 和GSTM1 上調蛋白密切相關[24]。血清中犬尿氨酸和色氨酸的比值可用來評價卵巢癌對順鉑的耐藥程度及預后[25]。次黃嘌呤可作為血清標志物用來預測卵巢癌鉑類耐藥[26]。這些代謝物在輔助診斷乳腺癌曲妥珠單抗耐藥中可能具有潛在的價值。

通過對曲妥珠單抗耐藥和敏感細胞中的差異代謝物以及代謝通路分析，初步發現了谷氨酰胺和谷氨酸等差異代謝物作為輔助診斷HER2 陽性乳腺癌曲妥珠單抗耐藥的價值。另外在代謝通路中所涉及的代謝酶可能是治療曲妥珠單抗耐藥的潛在靶點。但是，本研究中基于細胞模型所篩選出的代謝物差異，尚未被證明與曲妥珠單抗耐藥具有因果關系。因此，還需通過靶向代謝組學方法對細胞以及大量臨床樣本分析進行結果的驗證。

4 小結

綜上所述，本研究通過UHPLC-MS/MS 技術，采用非靶向代謝組學方法分析了HER2 陽性乳腺癌耐藥和敏感細胞之間代謝物的差異，篩選出谷氨酰胺和谷氨酸等15 個差異代謝物，挖掘出9 條代謝通路具有統計學意義，從這些代謝通路中可能會尋找到一些與逆轉曲妥珠單抗耐藥有關的潛在靶點，為研究曲妥珠單抗耐藥提供了一些思路；并且為進一步研究HER2 陽性乳腺癌細胞對曲妥珠單抗敏感，向曲妥珠單抗耐藥轉變過程中代謝物的差異變化，以及為生物標志物的探索提供了代謝組學的實驗依據，為曲妥珠單抗耐藥的研究提供相關理論參考。