同步檢測馬鈴薯6 種病毒試紙條與ELISA 方法比較分析

劉衛平

（黑龍江省農業科學院克山分院，齊齊哈爾 161000）

馬鈴薯具有適應性強、產量高、營養豐富等特點。它既可作為糧食，又可作為蔬菜，還可作為飼料和工業原料，是具有多種用途的經濟作物；馬鈴薯的營養成分既豐富又齊全，集蔬菜與糧食作物的優點于一身，且彌補了蔬菜及糧食作物營養中的不足。世界范圍內，中國馬鈴薯的種植面積最大、總產量最高，但單產水平低，黑龍江省馬鈴薯單產水平低于世界平均單產水平。造成馬鈴薯單產水平低的主要原因是馬鈴薯脫毒種薯的質量達不到國家標準[1]，容易被馬鈴薯病毒侵染而退化，致使馬鈴薯的產量降低、品質下降。馬鈴薯病毒的檢測技術是提高馬鈴薯脫毒薯質量的主要技術手段[2]。目前國內外通用的檢測馬鈴薯病毒的技術是酶聯免疫吸附實驗技術（以下簡稱ELISA 方法），這是一種在實驗室由專門的技術人員利用精密儀器才能完成的實驗；該項技術不能推廣應用普及到基層單位，大部分馬鈴薯種薯企業、合作社及種植大戶不能利用這項技術來監測本企業、本合作社馬鈴薯田的馬鈴薯病毒的發生情況，也就不能對馬鈴薯病毒及時地進行防控，造成馬鈴薯病毒感染，馬鈴薯田的病毒感染率超出馬鈴薯種薯的國家標準要求，致使馬鈴薯脫毒種薯的質量差[3]，馬鈴薯單產水平低，且遠遠低于發達國家的馬鈴薯單產水平。

荷蘭馬鈴薯種薯的質量高，出口到很多國家，主要是因為荷蘭有很好的馬鈴薯種薯質量檢測認證體系。馬鈴薯種薯質量檢測認證是控制馬鈴薯種薯質量最有效的手段。利用同步檢測馬鈴薯6 種病毒的試紙條對馬鈴薯的各個級別的種薯田進行病毒檢測，可以提高馬鈴薯種薯企業和合作社馬鈴薯種薯的質量，使各個級別的馬鈴薯種薯的質量達到國家種薯標準，經過認證合格后，準許進入馬鈴薯種薯市場。為了建立我國完善的馬鈴薯種薯質量檢測認證體系，全國農業技術推廣服務中心為探索種子質量認證制度，總結種子認證工作內在規律，完善種子認證程序，從2017 年開始進行了種子認證試點示范項目的田間檢驗，為建立健全種子認證制度提供科學依據。參加種子認證試點示范項目的企業有雪川農業發展股份有限公司、黑龍江龍薯馬鈴薯種薯繁育有限公司、內蒙古坤元太和農業科技有限公司、黑龍江萬田金農業科技發展有限公司、寧夏固原天啟薯業有限公司、依安縣天潤薯業有限公司。參加田間檢驗的品種有費烏瑞它（原種、一級種）、夏波蒂（原種）、中薯5 號（原種、一級種）、興佳2 號（原種、一級種）、尤金（原種、一級種）、雪川1號（原種）、青薯9 號（原種）。通過幾年來馬鈴薯種子認證試點示范項目的田間檢驗，取得了良好的效果，上述企業的種薯均達到國家標準，以此可以帶動所有的馬鈴薯種薯企業進行質量檢測認證；每個企業和種薯質量監管部門均可以利用同步檢測馬鈴薯6 種病毒試紙條監控馬鈴薯田6 種馬鈴薯病毒的發生情況，為馬鈴薯的綜合防控和馬鈴薯種薯級別的定級提供理論基礎。我國馬鈴薯種薯的質量和產量將有大幅度提高。

1 兩種馬鈴薯病毒檢測技術原理對比

膠體金是一種常用的標記技術，是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術，有其獨特的優點。將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠體金標記試劑（抗體或單克隆抗體）吸附在結合墊上，當待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過毛細作用向前移動，溶解結合墊上的膠體金標記試劑后相互反應，再移動至固定的抗原或抗體的區域時，待檢物與金標試劑的結合物又與之發生特異性結合而被截留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結果。該方法也就是免疫層析法，現已發展成為常用的試紙條檢測，使用十分方便。

ELISA 方法的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價結合，此種結合不會改變抗體的免疫學特性，也不影響酶的生物學活性。此種酶標記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發生特異性結合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現顏色反應。因此，可通過底物的顏色反應來判定有無相應的免疫反應，顏色反應的深淺與標本中相應抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應可通過ELISA 檢測儀進行定量測定，這樣就將酶化學反應的敏感性和抗原抗體反應的特異性結合起來，使ELISA 方法成為一種既特異又敏感的檢測方法。

2 兩種檢測技術檢測地點的對比

常規的ELISA 方法檢測馬鈴薯病毒只能在實驗室進行，對于有檢測馬鈴薯病毒能力的科研單位、大學，需要到馬鈴薯田把馬鈴薯葉片采集到實驗室即可做馬鈴薯病毒檢測；對于沒有馬鈴薯病毒檢測能力的馬鈴薯種薯企業、合作社、種植大戶，需要到馬鈴薯田采集馬鈴薯葉片，進行保鮮處理，然后將樣品送到或郵到具有馬鈴薯病毒檢測資質的科研單位的實驗室等候檢測。

快速試紙條檢測馬鈴薯病毒可以在任何有馬鈴薯的地方，比如田間地頭、貯藏窖、馬鈴薯的發運地點、海關等地進行就地取樣、就地檢測、就地讀取馬鈴薯病毒檢測結果，還可以及時地根據檢測結果進行馬鈴薯病毒的綜合防控和馬鈴薯脫毒種薯的定級。

3 兩種檢測技術檢測儀器和檢測人員的對比

利用ELISA 方法進行馬鈴薯病毒檢測必須經過精密的高價格儀器才能讀取出檢測結果；而快速試紙條檢測馬鈴薯病毒的結果讀取不需要經過儀器，只是通過肉眼就可讀取。

ELISA 方法檢測必須要由專門的技術人員進行，該實驗步驟繁瑣，需要配制多種檢測所需的試劑，需要調試并應用多臺高精密儀器；而快速檢測馬鈴薯病毒的試紙條的使用者很廣泛，任何馬鈴薯的種植者都能夠利用該試紙條進行馬鈴薯病毒的檢測。

4 兩種檢測技術檢測時間和檢測費用的對比

ELISA 方法檢測因檢測步驟繁瑣，且每個步驟孵育的時間較長，完成整個檢測實驗的時間需要2d；而快速試紙條檢測馬鈴薯病毒只需要5～10min就能完成。

ELISA 方法檢測，如果是檢測馬鈴薯的6 種主要的病毒，每份樣品需要150 元；如果馬鈴薯種薯企業、合作社以及種植大戶本身沒有檢測能力，需要將樣品送到具有馬鈴薯病毒檢測資質的單位進行檢測，每份樣品需要480 元；如果利用本團隊研究的同步檢測馬鈴薯6 種病毒的試紙條進行馬鈴薯病毒的檢測，每份樣品只需要70 元。由此看來，利用快速檢測試紙條檢測馬鈴薯病毒的費用是最低的。

5 兩種檢測技術靈敏度的對比

ELISA 方法檢測的靈敏度是10ng/mL，快速試紙條檢測馬鈴薯病毒的靈敏度是1ng/mL；由此看來，快速試紙條的檢測靈敏度高于常規的ELISA 方法檢測的靈敏度。

6 兩種檢測技術檢測結果讀取方法的對比

常規的ELISA 方法檢測不能現場取樣出檢測結果，快速試紙條檢測馬鈴薯病毒可以現場取樣、現場出檢測結果。常規的檢測技術中6 種馬鈴薯病毒需要6 個聚苯乙烯反應板才能夠完成檢測；快速檢測試紙條馬鈴薯6 種病毒的檢測僅需要1 個試紙條就能夠檢測；常規的檢測技術需要依靠儀器讀取馬鈴薯病毒檢測的結果，快速檢測試紙條只靠肉眼就能讀取檢測結果。

7 快速檢測試紙條的結構與特點

試紙條包括樣品墊、金標墊、NC 膜、檢測線T線、質控線C 線、吸水墊、PVC 底板。（1）將NC 膜粘貼在PVC 底板上；（2）將金標墊搭接在NC 膜一端的上方，搭接長度為1～2mm；（3）將吸水墊搭接在NC 膜另一端的上方，搭接長度為2～3mm；（4）將樣品墊搭接在金標墊的上方，搭接長度為2～3mm；（5）在斬切機中將粘貼好的PVC 底板剪切成條；（6）剪切成條后裝殼并和干燥劑一并裝入鋁箔袋，密封后貼上標簽。

特點:（1）方便、適用性廣。試紙條檢測馬鈴薯病毒無需專門的技術人員在實驗室完成，只需馬鈴薯種植者在馬鈴薯田間即可監測病毒的發生情況；為馬鈴薯病毒的綜合防控、馬鈴薯種薯定級提供技術支持。（2）快速。一個試紙條可在5～10min 時間內肉眼診斷出馬鈴薯是否感染病毒。（3）靈敏度、準確性高，特異性、穩定性強，檢測成本低。

8 討論

利用快速檢測試紙條對雪川農業發展股份有限公司、黑龍江龍薯馬鈴薯種薯繁育有限公司、內蒙古坤元太和農業科技有限公司、黑龍江萬田金農業科技發展有限公司、寧夏固原天啟薯業有限公司、依安縣天潤薯業有限公司6 個企業的馬鈴薯品種進行了病毒檢測，馬鈴薯Y 病毒和馬鈴薯S 病毒的檢出率最高，均是9%。因為馬鈴薯Y 病毒的傳播方式除了靠汁液摩擦傳播外，還主要依靠馬鈴薯蚜蟲傳播；馬鈴薯S 病毒是6 種馬鈴薯主要病毒中最難脫出的病毒；但是每個企業的馬鈴薯病毒的發生率均在馬鈴薯種薯國家標準的允許范圍內，均符合國家標準。

同步快速檢測馬鈴薯6 種病毒的試紙條使馬鈴薯病毒的檢測技術從實驗室走向田間地頭，檢測人員由專門的技術人員變為任何馬鈴薯種薯種植者。每個馬鈴薯種植企業和合作社均會使用該試紙條監控和檢測馬鈴薯種薯田馬鈴薯病毒的發生情況，為馬鈴薯種薯級別的定級和馬鈴薯病毒的綜合防控提供依據。每個企業可以利用試紙條了解馬鈴薯病毒的發生情況，及時采取防控措施，確保馬鈴薯種薯的質量。同步快速檢測馬鈴薯6 種病毒的試紙條在保證馬鈴薯種薯健康中起到關鍵作用。