堿溶性茯苓多糖的抗氧化作用

羅卓雅，譚宏淵，謝佳琳，田帝，胡婷，吳鵬

（黃岡師范學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)資源學(xué)院，湖北 黃岡 438000）

茯苓（Poria cocos）系多孔菌科真菌茯苓，被譽(yù)為中藥“四君八珍”之一，為國(guó)家藥食同源中藥材品種[1]。茯苓多糖是茯苓菌核中占比較高的生物活性成分[2]。國(guó)內(nèi)外研究表明茯苓多糖具有多種功能特性[3-6]，如增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)、抗腫瘤、抗氧化、抗炎等[7-10]，其在食品加工及醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用較為廣泛。

目前，提取茯苓多糖的方法有很多，如復(fù)合酶法[11]、微波輔助提取法[12]、熱水浸提法[13]等。復(fù)合酶法提取茯苓多糖，雖然效果好，但對(duì)酶解條件要求較高；微波輔助法提取茯苓多糖，提取率高，但溫度和時(shí)間都需要精準(zhǔn)控制；熱水浸提法提取茯苓多糖，提取時(shí)間長(zhǎng)且提取率較低。本試驗(yàn)利用堿液提取茯苓多糖，并采用傅里葉紅外光譜和紫外可見(jiàn)分光光譜對(duì)堿溶性茯苓多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步表征，再以VC為對(duì)照，對(duì)其體外抗氧化能力進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

九資河茯苓：市售；氫氧化鈉（分析純）：天津博迪化工股份有限公司；乙二胺四乙酸、維生素C（VC）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、鄰苯三酚、水楊酸、磷酸氫二鈉、檸檬酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、三羥甲基氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（DFT-200C）、真空冷凍干燥機(jī)（FDU-1200）：上海比朗儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-6）：金壇市順華儀器有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī)（TG16-WS）：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-2600）：島津儀器有限公司；傅里葉紅外光譜儀（Nicolet-6700）：美國(guó)熱電有限公司。

1.3 方法

1.3.1 堿溶性茯苓多糖的提取

1.3.1.1 茯苓粉制備

將茯苓塊洗凈烘干12 h后，用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩，即得茯苓粉。

1.3.1.2 堿液浸提

將濃度為0.6 mol/L的NaOH溶液與茯苓粉按照50∶1（mL/g）的液料比在 4 ℃恒溫水浴鍋中浸提 1 h[14]。堿液浸提結(jié)束后，取上清液，配制0.5 mol/L的鹽酸對(duì)其進(jìn)行中和，調(diào)節(jié)pH值為7，避免多糖在堿性條件下發(fā)生水解。

1.3.1.3 離心

中和后的多糖提取液在8 000 r/min條件下離心10 min，去除上清液，得到多糖沉淀。

1.3.1.4 真空冷凍干燥

采用真空冷凍干燥機(jī)，在-60℃～-50℃條件下將多糖沉淀真空冷凍12 h，即得堿溶性茯苓多糖。

1.3.2 傅里葉紅外光譜分析

利用傅里葉紅外光譜儀，在400 cm-1～4 000 cm-1波數(shù)下采用KBr壓片法對(duì)堿溶性茯苓多糖樣品進(jìn)行掃描分析[15]。

1.3.3 紫外可見(jiàn)分光光譜分析

利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，通過(guò)固體樣品掃描法對(duì)堿溶性茯苓多糖樣品進(jìn)行掃描[16]，掃描波長(zhǎng)為190 nm～600 nm。

1.3.4 抗氧化能力測(cè)定

1.3.4.1 還原能力的測(cè)定

在5支試管中分別加入2.5 mL不同濃度的多糖樣品溶液[17]、2.5 mL pH6.6磷酸鹽緩沖溶液，混勻后，加入2.5 mL的1%鐵氰化鉀溶液，搖勻后于50℃水浴20min。加入2.5mL的10%三氯乙酸溶液，于3000r/min離心10 min后，取上清液5 mL，分別添加5 mL蒸餾水和1 mL的0.1%三氯化鐵溶液，于700 nm測(cè)定吸光度A[18]。以蒸餾水替代樣品溶液作為空白組，于700 nm測(cè)定吸光度A0，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，取平均值，以VC為對(duì)照。還原能力（ΔA）計(jì)算公式如下。

1.3.4.2 DPPH自由基清除能力測(cè)定

在5支試管中分別加入不同濃度多糖樣品溶液2.5 mL，再加入2 mL的0.15 mmol/L DPPH-乙醇溶液[19]，搖勻后靜置30 min，測(cè)定其吸光度（AX）；以2 mL無(wú)水乙醇代替樣品溶液后測(cè)定其吸光度（A0）；取等濃度的樣品溶液與相等體積無(wú)水乙醇混合，測(cè)定其吸光度（AX0）。試驗(yàn)平行測(cè)定3次，取平均值，以VC為對(duì)照。DPPH自由基清除率計(jì)算公式[20]如下。

1.3.4.3 超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定

在5支試管中分別加入2.5 mL不同濃度多糖樣品溶液，再加入5.7 mL的100 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.2）[21]，置于25℃水浴鍋中恒溫水浴10 min。然后加入25℃預(yù)熱好的6 mmol/L鄰苯三酚溶液0.1 mL，搖勻后，在320 nm處測(cè)定其反應(yīng)1 min時(shí)的吸光度（A）[22-23]。再取第6支試管用0.2 mL蒸餾水代替0.2 mL樣品溶液作為空白組，其余試劑不變，于320 nm處測(cè)定其反應(yīng)1 min時(shí)的吸光度（A0）。超氧陰離子自由基清除計(jì)算公式如下。

1.3.4.4 羥基自由基清除能力測(cè)定

在5支試管中依次加入1.5mL的0.75mmol/L鄰二氮菲試劑[24]、3 mL pH7.4的150 mmol/L磷酸緩沖液[25]、1.0 mL的0.75 mmol/L FeSO4試劑，迅速混勻，再分別加入3 mL不同濃度的多糖樣品溶液，1 mL 0.01%的H2O2溶液，用蒸餾水定容至10 mL，水浴溫度設(shè)置為37 ℃，加熱 1 h，在 510 nm 處測(cè)定其吸光度（AX）[26]。在1支試管中不添加FeSO4試劑和H2O2溶液，其余步驟均相同，在510 nm處測(cè)定其吸光度（A1）。在另一只試管中添加H2O2溶液，不加FeSO4試劑，其余步驟均相同，在510 nm處測(cè)定其吸光度（A0）。

羥基自由基清除率計(jì)算公式如下[27]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2019軟件進(jìn)行處理，并采用SPSS20.0進(jìn)行差異顯著性分析，以P＜0.05為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，用Origin 2021作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 傅里葉紅外光譜掃描分析

堿溶性茯苓多糖紅外光譜掃描圖譜見(jiàn)圖1。

由圖1可知，3 419 cm-1處強(qiáng)且寬的吸收峰為O—H與C—H的伸縮振動(dòng)，為糖類物質(zhì)的特征吸收峰；在2890cm-1處為C—H的伸縮振動(dòng)吸收峰、1640cm-1處為CO的伸縮振動(dòng)吸收峰；在1 372 cm-1處為C（CH3）2面內(nèi)彎曲振動(dòng)吸收峰、1 162 cm-1處為C—O面內(nèi)彎曲振動(dòng)吸收峰；1 078 cm-1和1 039 cm-1處均為C—O—C的伸縮振動(dòng)吸收峰；890 cm-1處的吸收峰為C—H面外彎曲振動(dòng)。由此表明提取得到的堿溶性茯苓多糖樣品是β型多糖。

2.2 紫外可見(jiàn)分光光譜掃描分析

堿溶性茯苓多糖紫外可見(jiàn)吸收光譜見(jiàn)圖2。

由圖2可知，提取的堿溶性茯苓多糖在波長(zhǎng)約230 nm處有典型的糖類物質(zhì)特征吸收峰，且僅有一個(gè)特征吸收峰，而研究表明核酸和蛋白質(zhì)的紫外吸收?qǐng)D譜中均無(wú)此特征吸收峰[28]，進(jìn)一步說(shuō)明此多糖為均一組分。

2.3 還原能力測(cè)定

試驗(yàn)以VC作為參照，采用鐵氰化鉀還原法考察堿溶性茯苓多糖的還原能力，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，堿溶性茯苓多糖和VC的還原能力均隨著濃度的增加逐步增大。濃度為0.2 g/L～0.4 g/L時(shí)，VC的還原能力高于堿溶性茯苓多糖，當(dāng)濃度到達(dá)一定值（0.6 g/L）后，VC的還原能力低于堿溶性茯苓多糖。當(dāng)濃度為1.0 g/L時(shí)，堿溶性茯苓多糖達(dá)到本試驗(yàn)所設(shè)濃度梯度范圍內(nèi)的最大還原能力。

2.4 DPPH自由基清除能力

堿溶性茯苓多糖及VC的DPPH自由基清除能力見(jiàn)圖4。

由圖4可知，堿溶性茯苓多糖的DPPH自由基清除率高于VC。濃度為0.2 g/L～0.8 g/L時(shí)，DPPH自由基清除率隨濃度增加而升高，濃度為0.8 g/L～1.0 g/L時(shí)DPPH自由基清除率隨濃度增加緩慢下降。當(dāng)濃度為0.8 g/L時(shí)，堿溶性茯苓多糖的DPPH自由基清除率最大，為61.21%，說(shuō)明堿溶性茯苓多糖有較好的DPPH自由基清除能力。

2.5 超氧陰離子自由基清除能力

堿溶性茯苓多糖及VC的超氧陰離子自由基清除能力見(jiàn)圖5。

由圖5可知，堿溶性茯苓多糖清除超氧陰離子自由基的能力隨濃度增大呈上升趨勢(shì)，張培等[29]的研究也發(fā)現(xiàn)茯苓多糖的超氧陰離子自由基清除率與其濃度呈正相關(guān)。在所選試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，堿溶性茯苓多糖超氧陰離子自由基清除率隨濃度增加快速升高，但均低于VC，在濃度為1.0 g/L時(shí)，超氧陰離子自由基清除率達(dá)到最大值，為63.27%。

2.6 羥基自由基清除能力

堿溶性茯苓多糖及VC對(duì)羥基自由基的清除能力見(jiàn)圖6。

由圖6可知，堿溶性茯苓多糖的羥基自由基清除率隨著濃度的增加逐漸上升，但增長(zhǎng)較緩慢。堿溶性茯苓多糖的羥基自由基清除率略低于VC。在濃度為1.0 g/L時(shí)，堿溶性茯苓多糖的羥基自由基清除率達(dá)到最大值，為62.32%，可見(jiàn)堿溶性茯苓多糖對(duì)羥基自由基有較好的清除能力。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用堿法提取九資河茯苓多糖，得到的堿溶性茯苓多糖為β型多糖。通過(guò)測(cè)定其還原能力和對(duì)3種不同體系自由基的清除率，研究了堿溶性茯苓多糖的體外抗氧化活性。試驗(yàn)結(jié)果表明，九資河堿溶性茯苓多糖抗氧化能力較強(qiáng)，且在考察濃度范圍內(nèi)，隨著堿溶性茯苓多糖的濃度增加，其還原能力逐步增強(qiáng)。雖然在超氧陰離子自由基和羥基自由基清除能力試驗(yàn)中，堿溶性茯苓多糖的超氧陰離子自由基和羥基自由基清除率均略低于VC，但仍具有一定的自由基清除能力。本試驗(yàn)為九資河堿溶性茯苓多糖的提取和應(yīng)用提供了新思路，為九資河茯苓的深加工提供參考。