飼料中添加太子參提取液對大黃魚血液免疫指標的影響

黃偉卿，湯桂津，吳秀珠，劉 錚，林培華，阮少江，郭團玉，宋 煒

(1.寧德師范學院生命科學學院，福建寧德 352100；2.閩東水產(chǎn)品精深加工福建省高校工程研究中心，福建寧德 352100；3.福建省寧德市鼎誠水產(chǎn)有限公司，福建寧德 352100；4.廈門海洋職業(yè)技術(shù)學院海洋生物學院，福建廈門 361000；5.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090)

大黃魚(Larimichthyscrocea)屬鱸形目(Perciformes)石首魚科(Sciaenidae)黃魚屬(Larimichthys)，主要分布在我國南海、東海和黃海南部，為暖水性集群洄游魚類，生活于近海的中、下層，因其具有肉質(zhì)細嫩，味道鮮美，營養(yǎng)價值高等特點，深受廣大消費者的青睞[1-2]。20世紀70年代，大黃魚海上捕撈量高達12萬t，位于我國四大傳統(tǒng)魚類的主捕對象之首[3-4]。后因過度捕撈，大黃魚種質(zhì)資源日漸匱乏，瀕臨枯竭。為對大黃魚種質(zhì)資源進行保護，1985年水產(chǎn)科技人員利用福建省寧德市官井洋為大黃魚內(nèi)灣性產(chǎn)卵場，在第6個國家五年計劃期間突破了大黃魚親本保活、馴養(yǎng)、人工育苗等技術(shù)瓶頸，首創(chuàng)大黃魚全人工繁養(yǎng)技術(shù)。經(jīng)過30多年的發(fā)展，2020年其產(chǎn)量達22.6萬t，居海水養(yǎng)殖魚類之首，成為我國八大優(yōu)勢出口養(yǎng)殖水產(chǎn)品之一，是最大規(guī)模的海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類[4-8]。但近年來，大黃魚養(yǎng)殖過程中不僅存在著人工配合飼料的開發(fā)和應用水平較低問題，還存在以鮮雜魚為主要餌料不僅容易滋生病菌引發(fā)病害，而且還會惡化養(yǎng)殖環(huán)境，導致大黃魚感染刺激隱核蟲等寄生蟲病，繼而感染弧菌等細菌性疾病等問題，導致大黃魚的死亡率升高，嚴重制約大黃魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[9-11]。在治療大黃魚疾病方面，以抗生素治療所取得的效果最佳，但抗生素類藥物終身殘留，并隨著食物鏈的富集作用，最終會對人體產(chǎn)生毒副作用[12]。自中國共產(chǎn)黨第十九次全國代表大會以來，畜牧綠色現(xiàn)代化養(yǎng)殖已成為民生健康和食品安全問題，成為養(yǎng)殖業(yè)的關(guān)注熱點，人們迫于尋求綠色健康的替抗藥品，中草藥因其天然、低殘留和不易產(chǎn)生耐藥性的特點，已得到廣泛關(guān)注并開展大量的研究[13-14]。已有多位學者證實，在飼料中添加黃芩、黃連、穿心蓮、大黃、金銀花、黃芪、丹參等單方或復方飼料能夠有效提高水產(chǎn)動物的免疫活性[15-18]。

太子參(Pseudostellariaheterophylla)是一種常見的藥食兩用中藥材，富含太子參多糖類、環(huán)肽類、皂甙類、氨基酸、微量元素等活性物質(zhì)，具有益氣健脾，抵抗疲乏勞累、對抗應激反應、增強機體免疫力等作用[19]。目前太子參及其產(chǎn)物在畜牧業(yè)中已有較多應用，吳建華等研究報道，太子參須使仔豬機體巨噬細胞的吞噬活性得到提高，網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能增強，明顯提高了機體對疫苗的免疫反應[20]。都廣禮研究表明，太子參能有效提高家禽的免疫力，具有抗擊禽流感的作用[21]。阮少江等將太子參提取液作為大黃魚的飼料添加劑，結(jié)果表明，太子參對促進大黃魚的抗病、生長、形體性能和肌肉品質(zhì)均有一定的促進和改良效果，但對大黃魚免疫的影響還未見深入探究[22-23]。

血液參與生命體主要的代謝過程，維持機體內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定，血液指標是否正常經(jīng)常用于衡量生物體是否健康[24-25]。此外，通過測定魚類血液中白細胞的吞噬功能，可以了解其免疫狀況[26]。本試驗利用太子參的藥效功能，將太子參提取液添加至飼料中，通過定期測定血液免疫指標，研究其對大黃魚免疫的影響，以期為開發(fā)提高大黃魚品質(zhì)、抗病性、產(chǎn)量和食用安全的綠色人工配合飼料添加劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用魚：大黃魚購于寧德市鼎誠水產(chǎn)有限公司，挑選體形完整、活力好的幼魚，平均體長為(10.70±1.63) cm，體質(zhì)量為(12.73±5.48) g。

太子參下腳料提取液的制備：采用熱水浸提法提取太子參提取液，選取太子參根須，洗凈，常溫風干，研磨成粉，過60目篩，分別取8.75 g粉末于4個錐形瓶中，加入200 mL蒸餾水，于95 ℃的恒溫水浴鍋中浸提4 h，經(jīng)抽濾、濃縮、煮沸滅菌后定容至350 mL，制得40 mg/mL的太子參提取液，將該提取液保存于4 ℃冰箱中備用。

試驗用飼料：采用海馬牌大黃魚人工配合飼料(粗脂肪含量≥6.0%，粗蛋白含量≥45.0%賴氨酸含量≥2.8%，粗灰分含量≤14.0%，粗纖維含量≤5.0%，鈣含量為1.0%～3.0%，總磷含量≥1.0%，氯化鈉含量為0.5%～3.0%，水分含量≤10.0%)。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2019年9月在寧德師范學院生物實驗樓循環(huán)水養(yǎng)殖實驗室進行，設(shè)置不添加太子參提取液的為對照組，以添加太子參提取液(濃度：40 mg/mL)添加量分別為0.5%(C0.5)、1.0%(C1.0)、1.5%(C1.5)、2.0%(C2.0)為試驗組。每組設(shè)置3個平行試驗，每組300尾大黃魚幼魚。

1.3 養(yǎng)殖管理

采用循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)養(yǎng)殖大黃魚，養(yǎng)殖水體溶氧量保持在5 mg/L以上、pH值范圍為7.9～8.2、水溫保持在23.5～24.5 ℃、鹽度在20～28之間、氨氮含量保持在0.20 mg/L以下；于每日09：30及18：00飼喂餌料，每次飼喂餌料為魚體體質(zhì)量的 1%～2%，并根據(jù)大黃魚具體攝食情況酌情調(diào)整；每日保活吸污、按時換水、撈取死魚并做好養(yǎng)殖記錄。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 血清的制備 正常攝食餌料，幼魚飼喂15、30、60、120 d后，對試驗組、對照組每組隨機取3尾進行尾靜脈采血，采血量為2 mL，血液靜置于室溫下1 h，待其凝固后，放到4 ℃冰箱中，冷藏4 h后取出，于高速冷凍離心機中離心，條件為4 ℃、4 000 r/min，時間為10 min，收集血清用于后續(xù)相關(guān)指標的測定。

1.4.2 大黃魚血清免疫球蛋白(IgG)含量的測定 選用南京建成生物工程研究所的IgG試劑盒，以免疫比濁法進行測定。

1.4.3 大黃魚血清免疫酶活性的測定 血清超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定：選用南京建成生物工程研究所的SOD檢測盒(貨號：A001-1)以黃嘌呤氧化酶法，又名羥胺法的相關(guān)步驟進行操作。

血清過氧化氫酶(CAT)活性的測定：測定所用試劑盒來自南京建成生物工程研究所(貨號：A007-1)，按可見光法的相關(guān)步驟進行測定。

血清溶菌酶(LZM)活性的測定：選用南京建成生物工程研究所的LZM試劑盒(貨號：A050)，以空白對照法進行測定。

1.4.4 大黃魚吞噬細胞吞噬功能的測定 將金黃色葡萄球菌(Staphyloccoccusaureus)經(jīng)轉(zhuǎn)管培養(yǎng)后，同生理鹽水制成相應的菌懸液，經(jīng)滅活后存入4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫诓煌娘曃箷r間隨機從各試驗組中取3尾大黃魚進行抽血，注意使用肝素鈉抗凝劑防止血液凝固，后將血液與菌懸液混合，制成血涂片，并用堿性美藍染色，后經(jīng)洗滌晾干，便可進行觀察。根據(jù)白細胞所具備的相關(guān)特點，準確找到30個白細胞，數(shù)出吞噬細菌的白細胞數(shù)和白細胞吞噬金色黃葡萄球菌數(shù)。計算公式[25]如下：

吞噬百分率=觀察白細胞總數(shù)中參與吞噬的白細胞數(shù)/觀察數(shù)×100%；

吞噬指數(shù)=吞噬的的細菌總數(shù)/觀察數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0處理軟件中的單因素方差分析，用Duncan’s多重比較分析差異顯著性，試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加太子參提取液對大黃魚血清IgG含量的影響

對照組和C0.5組在養(yǎng)殖周期內(nèi)，血清中IgG含量呈現(xiàn)在15～30 d先上升，30 d后下降，至60 d后再上升的趨勢；C1.0和C2.0組血清中IgG含量呈現(xiàn)為先上升后下降的趨勢；C1.0組飼喂60 d后，血清中IgG含量趨于平穩(wěn)；C1.5組血清中IgG含量呈現(xiàn)在 15～30 d時先下降，30～60 d時上升，而后又下降的趨勢。飼喂60 d，試驗組血清中IgG含量隨添加太子參提取液濃度的增加呈上升趨勢。飼喂30 d時，C1.0組血清中IgG含量達到最高，為(0.42±0.06) g/L。除120 d外，試驗組血清中IgG含量均高于對照組(圖1)。

2.2 添加太子參提取液對大黃魚血清免疫酶活性的影響

飼喂添加太子參提取液120 d，各試驗組血清中SOD活性變化情況見圖2-A，LZM活性變化情況見圖2-B，CAT活性變化情況見圖2-C。其中各組的SOD活性、對照組和C0.5和C2.0組血清中的LZM活性、對照組血清中的CAT活性均呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢，而C1.0和C1.5組血清中的LZM活性、C0.5、C1.0和C1.5組血清中的CAT活性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，C2.0組血清中的CAT活性呈現(xiàn)在15～30 d時先下降，30 d后上升，至60 d后再下降的趨勢。試驗組血清中SOD活性除 60 d 外，其他投喂時間均大于對照組。試驗組血清中的CAT活性除30 d和120 d外，其他處理均顯著高于對照組(P<0.05)。從60 d起，試驗組血清中SOD活性隨太子參提取液濃度的增加呈上升趨勢。在30 d時，C1.0試驗組血清中SOD活性達到最高，為(343.74±0.13) U/mg；30 d時，血清中LZM活性達到最高的為C0.5組，為(7.35±0.02) U/mL；飼喂15 d時，C1.5組血清中CAT活性達到最高值，為(5.75±0.02) U/mL。

2.3 添加太子參提取液對大黃魚吞噬細胞吞噬功能的影響

飼養(yǎng)60 d，試驗組的吞噬百分率與對照組差異不顯著(P>0.05)，僅C0.5試驗組吞噬百分率略高于對照組，C1.0組的吞噬百分率在前60 d均不如對照組高，而60 d后，該組的吞噬百分率顯著高于對照組(P<0.05)；養(yǎng)殖至120 d，各添加太子參提取液試驗組的吞噬百分率均顯著高于對照組(P<0.05)，C1.0組的吞噬百分率達到最高，為(63.3±0.03)%(圖3-A)。

飼養(yǎng)15 d，試驗組的吞噬指數(shù)均低于對照組；養(yǎng)殖至30 d，C0.5、C1.5和C2.0組的吞噬指數(shù)高于對照組，C1.0組的吞噬指數(shù)略低于對照組，但差異不顯著(P>0.05)；飼喂60 d，僅C0.5和C2.0組吞噬指數(shù)高于對照組；飼喂120 d，添加太子參提取液的各試驗組的吞噬指數(shù)均顯著高于對照組(P<0.05)，C1.0組的吞噬指數(shù)達到最大值，為2.70±0.10(圖3-B)。

3 討論與結(jié)論

3.1 太子參提取液對大黃魚血清免疫球蛋白含量的影響分析

免疫球蛋白是由淋巴細胞所制造產(chǎn)生的，是魚類的初級特異性免疫系統(tǒng)中的一個重要成分，在魚類特異性免疫過程中發(fā)揮了重要作用，可用于魚類抵抗疾病，防御病害。Siwicki等首次利用血清中的免疫球蛋白含量來評價魚類的免疫功能[27]；Adham等以血清蛋白、白蛋白和免疫球蛋白的含量變化作為檢測環(huán)境對魚類健康影響的免疫指標；在機體免疫過程中，免疫球蛋白起重要保護作用，能夠抵抗病菌、抵御病毒，促進魚體有效地預防相應的感染性疾病[28]。在本試驗中，添加太子參提取液對于大黃魚的血清免疫球蛋白含量具有一定的提高作用，表現(xiàn)為添加太子參提取液的各試驗組飼喂60 d及之前均高于對照組，但飼喂120 d后，各試驗組免疫球蛋白含量趨于穩(wěn)定，且均低于對照組。這與楊啟蓮等的試驗結(jié)果表明免疫球蛋白含量會在機體感病后的一段時間才會出現(xiàn)熟知的顯著變化[29]相符。

3.2 太子參提取液對大黃魚血清免疫酶活性的影響分析

LZM是生物體重要的非特異性免疫因子之一，具有殺菌、抗感染、誘導調(diào)節(jié)其他免疫因子合成和分泌、增加免疫力、修復傷口等功能[31，41]。本次在試驗前期，C0.5和C2.0組LZM活性顯著升高，這一結(jié)果與盛竹梅等采用五倍子為主要配方的復方中藥也可顯著提高鯽魚(Carassiusauratus)血清溶菌酶的活性研究結(jié)果[42]一致。同時還發(fā)現(xiàn)飼喂120 d，各試驗組溶菌酶活性均低于對照組，結(jié)果與石和榮等研究中發(fā)現(xiàn)的隨中草藥含量升高，酶活性降低的結(jié)論[43]相符。

過氧化氫體為不常見的細胞器，存在于機體內(nèi)的紅細胞及某些組織中，過氧化氫體的主要特點是儲存著CAT，該酶是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一，主要作用是催化清除體內(nèi)多余的過氧化氫，使細胞免于遭受H2O2的毒害[44]。本試驗采用太子參飼喂大黃魚15 d時，添加量為0.5%、1.0%及1.5%組的CAT活性顯著升高。這與李梅芳等投喂大黃、黨參和五倍子等6種中草藥顯著提高了大黃魚的血清CAT活性，增強了非特異性免疫活性結(jié)果[31]一致。

3.3 太子參提取液對大黃魚吞噬細胞的吞噬功能影響分析

魚類特異性免疫能力較弱，主要依靠非特異性免疫系統(tǒng)，白細胞的吞噬活性又是魚類非特異性免疫的重要組成部分[45-47]。試驗期間，各添加太子參提取液的試驗組白細胞吞噬活性隨時間推移總體呈上升趨勢，經(jīng) 120 d 的飼養(yǎng)，試驗組吞噬活性均高于對照組，說明太子參提取液具有提高大黃魚吞噬功能的功效。在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，試驗組和對照組大黃魚均出現(xiàn)了感染的白點內(nèi)臟，這可能導致吞噬活性增強[48]。

3.4 太子參提取液作為大黃魚飼料添加劑的可行性分析

近些年，大黃魚產(chǎn)業(yè)發(fā)展飛快，養(yǎng)殖戶為追求產(chǎn)量和利潤，不斷擴大養(yǎng)殖規(guī)模，養(yǎng)殖密度逐漸增加致使對養(yǎng)殖海區(qū)水體的破壞日益嚴重，惡化的養(yǎng)殖環(huán)境導致大黃魚因感染寄生蟲，繼而感染繼發(fā)性細菌病大量致死現(xiàn)象出現(xiàn)。目前在大黃魚人工配合飼料的開發(fā)和應用方面，水平仍較低[49-51]。本次研究表明，添加太子參提取液有利于提高大黃魚的非特異性免疫。同時太子參具有毒副作用小、無藥物殘留等優(yōu)點，兼有營養(yǎng)性和藥物性的雙重作用，能促進魚類機體免疫反應，提高其抗逆性。本試驗進一步表明，飼料中添加0.5%～1.5%太子參提取液(濃度40 mg/L)可提高大黃魚血清LZM、SOD、CAT的活性，IgG含量及吞噬功能，增強大黃魚的非特異性免疫機能，具有減少病害發(fā)生的可能，從而保證大黃魚的品質(zhì)安全。