西伯利亞鱘MHCⅡβ克隆、原核表達和多克隆抗體制備

田照輝，胡紅霞，王 巍，東 天，孫 愛

(北京農林科學院水產科學研究所暨國家淡水漁業工程技術研究中心，北京 100068)

主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC) 統稱為MHC分子，是高度多態的基因群，其編碼產物是一類細胞表面轉膜蛋白，非常復雜且最具多態性，廣泛存在于脊椎動物體內，與免疫功能密切相關[1-3]。MHC分子分為3類，其Ⅰ類、Ⅱ類分子參與抗原呈遞過程[4]。其中MHCⅡ類分子是由α鏈和β鏈組成的跨膜糖蛋白，主要在與呈遞抗原有關的細胞中表達，如B細胞、激活的T細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、單核細胞等細胞膜上[5]，主要功能是將外源性抗原呈遞給T細胞抗原受體TCR(T cell receptor，TCR)[6]。在病毒感染的過程中，某些病毒蛋白通過干擾MHCⅡ基因的功能，影響機體正常的免疫識別[7]。凡是能激活免疫細胞的刺激源，如感染的病原體、抗原以及各種炎癥反應，都能刺激局部組織發生MHC上調。細胞因子IFN-γ可誘發和增強免疫細胞(除B細胞外)表達Ⅱ類分子并增強它們的表達；腫瘤壞死因子TNF-α系統能上調白細胞介素4從而增強B細胞表達Ⅱ類分子[8]。

魚類MHCⅡ基因在魚類機體免疫中發揮著重要作用，淋巴組織和與免疫相關的脾臟、鰓、胃、前腸是魚類最易接觸病原體的部位，在魚類處于非抗原攻擊狀態下，MHCⅡ基因主要在這些器官或組織中表達[9]。魚類在對外部生存環境不斷適應的長期進化過程中，為了抵御病原的侵入，保護機體內部環境的穩態，MHCⅡ基因家族形成了極其豐富的多態性。自Hashimoto等于1990年首次報道了鯉(Cyprinuscarpio)的部分MHC基因序列以來[10]，國內外學者已對鱸魚(Dicentrarchuslabrax)[2]、赤點石斑魚(Epinephelusakaara)[1]、軍曹魚(Rachycentroncanadum)[11]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[12]等許多魚類的MHCⅡ類基因進行了研究。

西伯利亞鱘(Acipenserbaerii)為鱘科鱘屬，軟骨硬鱗類，是重要的鱘魚養殖品種和育種材料，具有重要的科研和經濟價值，被列為《瀕危動植物種國際貿易公約》附錄Ⅱ物種[13]。近年來，隨著鱘魚產業的發展壯大，鱘養殖病害問題也日益增多，嚴重制約著鱘魚產業的健康可持續發展[14]。目前對于鱘魚MHC基因的研究主要集中在物種進化方面，對其遺傳和免疫相關研究較少，不同魚類經抗原刺激后其MHCⅡβ基因表達情況并不一致。本課題組前期進行了西伯利亞鱘MHC基因的克隆、組織分布和細菌感染后的表達，但對其MHC免疫功能還缺乏深入研究[14]。鑒于MHCⅡβ基因的重要功能和表達的復雜性，本研究構建了原核高效表達載體，制備了效價高、特異性強的多克隆抗體，為深入研究西伯利亞鱘MHCⅡβ基因免疫學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和主要試劑

1.1.1 菌株、質粒和試驗動物EscherichiacoliBL21(DE3)感受態為TIANGEN公司產品，DH5α感受態由本實驗室制備保存；克隆質粒pGEM-T Vector購于Promega公司，為氨芐抗性；表達質粒Pet30α由北京市水產科學研究所水族研究室保存提供，為卡那霉素抗性，并帶有6-His標簽。西伯利亞鱘由北京市水產科學研究所鱘魚良種場提供。

1.1.2 主要工具酶及試劑 RNA提取和RNase-Free DNase Set試劑盒(Qiagen公司)，RT反轉錄試劑盒、6X His 標簽Tag抗體、辣根酶二抗(中杉金橋公司)，彩虹預染寬分子量蛋白Marker(北京寶如億生物公司)，膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒、ExTaqDNA聚合酶、Ryrobest DNA保真酶、DNA Marker(DL2000、DL10000)、T4DNA連接酶(Takara公司)，雙酶切所用酶NcoⅠ、XhoⅠ(NEB公司)。其他常規化學試劑均為化學優級純級。引物合成及序列測定由北京擎科生物工程有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計 試驗于2018年開始在北京市水產科學研究所陸續開展，首先在GenBank數據庫查找西伯利亞鱘MHCⅡβ基因序列(登錄號：JQ288773)，參照質粒載體Pet30α序列的酶切位點，用Primer 5.0軟件分析西伯利亞鱘MHCⅡβ基因酶切位點，并根據mRNA序列設計引物，擴增可讀編碼框除信號肽序列的699 bp，上游引物MHC-E-F：catgccatggctGTCGACGGTTACTTGATG，下游引物MHC-E-R：ccgctcgagTTAATCTGATGGCACCAA，并在上、下游引物的5′端分別引入NcoⅠ、XhoⅠ酶切位點(單下劃線)和保護堿基(雙下劃線)，引入酶切位點和保護堿基后擴增片段為720 bp。

1.2.2 基因擴增和構建克隆質粒T-MHCⅡβ試驗用西伯利亞鱘魚由北京市水產科學研究所國家級鱘魚良種場提供。取西伯利亞鱘脾臟組織，參照Qiagen總RNA抽提試劑盒說明書提取總RNA，反轉錄為cDNA。以脾臟cDNA為模板，利用引物MHC-E-F和MHC-E-R擴增MHCⅡβ目的片段，PCR 產物經電泳檢測，膠回收試劑盒純化后，連接于pGEM-T質粒載體，轉化大腸桿菌克隆菌株DH5α，進行藍白斑篩選，鑒定陽性的菌液由北京擎科生物工程有限公司測序，測序結果和參考序列比對，比對成功的菌液提質粒T-MHCⅡβ。

1.2.3 構建重組表達質粒Pet30α-MHCⅡβ以 T-MHCⅡβ質粒為模板，使用引物MHC-E-F、MHC-E-R和保真酶擴增MHCⅡβ目的片段，膠回收純化產物和質粒Pet30α分別作為底物進行NcoⅠ和XhoⅠ酶雙酶切：37 ℃ 2 h，80 ℃ 20 min，酶切產物膠回收純化后，將酶切后的質粒Pet30α和MHCⅡβ目的片段連接。連接產物轉化感受態細胞DH5α，在含有卡那霉素(Kan)的選擇性培養基上篩選陽性克隆，進行PCR菌液鑒定，陽性克隆交由北京擎科生物工程有限公司送檢測序，經序列比對后，選取測序正確的菌液，提取質粒Pet30α-MHCⅡβ，轉化到表達菌株E.coliBL21(DE3)中，在含卡那霉素(Kana)的選擇性培養基上篩選陽性克隆，接種到LB(Kana+)液體培養基過夜培養，再次進行PCR菌液鑒定測序，測序正確的菌液用甘油保存于-80 ℃備用，用于原核表達研究。將Pet30α空質粒轉化到表達菌株E.coliBL21(DE3)中為對照組。

1.2.4 Pet30α-MHCⅡβ在大腸桿菌中的原核表達和鑒定 將保存的構建好的表達菌株復蘇，挑選單克隆接種于LB(kana+)培養基，37 ℃180 r/min振蕩過夜。取過夜培養的菌液2 mL接種于200 mL液體LB(kana+)培養基中，37 ℃ 180 r/min振蕩至D600 nm=0.4～0.6時，加入1 mmol/L的IPTG誘導表達，不加IPTG的培養管作為對照組，37 ℃ 180 r/min 培養6 h收集菌液暫存于4 ℃冰箱備用。取1 mL表達菌液12 000 r/min離心5 min，棄上清，用200 μL PBS重懸菌液，加loading buffer混勻后煮沸5 min，再次離心后使用SDS-PAGE、Western Blot檢測表達蛋白。

1.2.5 蛋白質存在性質的鑒定 取100 mL誘導的培養物，4 000 r/min離心10 min收集菌體，加入 25 mL 的PBST緩沖液，冰浴10 min后超聲13 min。取裂解物1 mL，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，分離上清，沉淀直接制備電泳樣品。往上清中加入1/10體積的三氯醋酸TCA混勻，振蕩15 s，置冰上放置至少15 min，然后14 000g(13 770 r/min)離心 10 min，去上清，加入100 μL丙酮混合，14 000g離心5 min洗沉淀2次，從沉淀中去除丙酮，風干沉淀(將蓋子打開至少60 min)。往菌體超聲裂解的沉淀物及TCA沉淀的蛋白中加入100 μL PBS和 100 μL SDS上樣緩沖液振蕩混合，置于沸水中加熱 5 min，再次離心后進行SDS-PAGE電泳和Western Blot鑒定。

1.2.6 最適表達時間和最適表達溫度 取含有融合質粒Pet30α-MHCⅡβ過夜培養的單克隆菌液，以1%的比例接種于200 mL的LB(Kana+)培養基中，當D600 nm達到0.4～0.6時，加入1 mmol/L的IPTG，180 r/min 37 ℃分別誘導2、4、6、8 h，同時設置 180 r/min 27 ℃誘導8 h作為溫度對照組及不加IPTG的對照組和Pet30α空質粒對照組。

1.2.7 鎳柱層析純化表達蛋白 收集破碎后的菌體，用含有8 mol/L尿素的BufferA溶解包涵體，12 000 r/min 離心20 min，取菌體上清，用BufferA+8 mol/L尿素平衡鎳柱，加入包涵體裂解上清，過柱，洗去非特異性結合，洗脫鎳柱上結合的重組蛋白，SDS-PAGE電泳鑒定濃縮的重組蛋白(圖)。采用10 ku的超濾管對蛋白進行濃縮，到終體積為 2 mL，-80 ℃保存。

1.2.8 多克隆抗體制備及檢測 以純化重組蛋白為免疫原，免疫2只新西蘭大白兔，抗原濃度為 1 μg/mL，注射劑量為100 μg/只，腿部肌肉皮下多點注射。共免疫9次，每次間隔15 d，從第3次免疫開始，每次免疫7 d 后采血檢測抗體效價，第7次采血得到抗體后，進行了采全血與純化及純化后的ELISA、SDS-PAGE檢測。

2 結果與分析

2.1 擴增得到用于蛋白表達的基因序列

以提取的總RNA反轉錄合成的cDNA為模板，以MHC-E-F和MHC-E-R引物進行PCR擴增，產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，可見約720 bp的擴增片段，與預期大小相符(圖1)。擴增片段測序結果與參考基因序列比對，沒有插入、缺失和移碼突變，可用于構建原核融合表達質粒。

2.2 構建重組質粒Pet30α-MHCⅡβ

以T-MHCⅡβ質粒為模板使用保真酶擴增的MHCⅡβ膠回收產物、Pet30α質粒進行NcoⅠ和XhoⅠ 雙酶切，酶切產物瓊脂糖凝膠電泳結果見圖2，酶切后的Pet30α在5 400 bp處、MHCⅡβ在 720 bp 處有目的片段，酶切成功后，用T4連接酶連接構建Pet30α-MHCⅡβ質粒，轉化E.coliBL21(DE3)后，進行菌液鑒定，陽性克隆再次送檢測序，測序正確的菌株用于蛋白表達。

2.3 重組蛋白的理化性質預測

軟件分析表明，Pet30a-MHCⅡβ重組蛋白含837 bp堿基，編碼237個氨基酸，蛋白分子量為 31 287.40 u，包括31個強堿性氨基酸(K、R)，39個強酸性氨基酸(D，E)，81個疏水氨基酸(A、I、L、F、w、V)，71個極性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)；等電點6.211，在pH值7.0時帶5.889電荷；蛋白序列含有6個組氨酸融合標簽，便于免疫印跡鑒定和蛋白純化。利用在線工具http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/預測，表達蛋白具有6個糖基化位點(閾值為0.5，附加閾值為0.32、0.75、0.90)(圖3)。

2.4 Pet30α-MHCⅡβ在大腸桿菌中的表達

含重組質粒Pet30α-MHCⅡβ的大腸菌BL21(DE3)經IPTG誘導培養后，將菌液收集進行SDS-PAGE電泳，可見大小約為36 ku的濃染蛋白帶，用DNAstar預測Pet30α-MHCⅡβ表達的融合蛋白大小為32 ku，與彩虹預染蛋白Marker指示的36 ku大小略有差異，但基本相符，對表達的融合蛋白進行免疫印跡檢測，Western Blot檢測結果陽性說明該蛋白是目的蛋白。將菌液超聲波裂解后的上清和沉淀中的蛋白進行SDS-PAGE電泳(圖4)，對表達的蛋白進行免疫印跡檢測(圖5)，可見沉淀中的濃染蛋白含量大于上清中的濃染蛋白量，可知該融合蛋白為包涵體蛋白。

將不同表達時間和表達溫度培養的菌液收集處理后進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色，1 mmol/L IPTG誘導2、4、6、8 h均可檢測到明顯的濃染蛋白帶，未加IPTG誘導檢測到較低含量的蛋白條帶，未加IPTG和加IPTG誘導的Pet30α空質粒對照均無蛋白條帶(圖6)。用伯樂凝膠成像Image Lab進行條帶灰度分析：誘導4 h蛋白表達量最高；在27 ℃誘導8 h的蛋白條濃度低于相同條件 37 ℃ 誘導的蛋白濃度。Western Blot顯示融合蛋白條帶清晰特異性強。

2.5 蛋白表達純化

純化濃縮后的蛋白含量為1 mg/mL，SDS-PAGE電泳檢測濃縮的重組蛋白(圖7)，在36 ku處有較濃的條帶。

2.6 多克隆抗體

免疫后大白兔的血清樣品經過離心，過柱，得到的抗體進行超濾處理，純化后的抗體ELISA檢測抗體效價為240 W，SDS-PAGE電泳(圖8)、Western Blot顯示，純化的抗體可與抗原特異性結合。

3 討論

3.1 引物設計和基因擴增

脾臟是是重要的免疫器官[13]，硬骨魚類受到外源刺激后，其脾、腎、肝等器官中的黑色素巨噬細胞增多[15]，MHCⅡβ基因在西伯利亞鱘脾臟組織中有較高的基礎表達[14]。因此本研究以富含淋巴細胞的西伯利亞鱘脾臟為材料，提取RNA，進行反轉錄，擴增MHCⅡβ基因。引物設計引入的酶切位點應避免在擴增的基因內部出現，質粒PET30a在N端和C端各有1個6-His標簽，插入目的基因后C端的6-His標簽在終止密碼子之后不再表達，因此引物設計只保留了N端的6-His標簽，用于Western免疫印跡和蛋白純化。

3.2 重組蛋白的分子量

試驗中用于構建重組質粒的西伯利亞鱘MHCⅡβ的OFR為801 bp，其中信號肽序列為102 bp，用于構建的重組蛋白不包含此信號肽序列，為699 bp，編碼233aa，構建的Pet30α-MHCⅡβ融合蛋白為278aa，使用DNAstar中的Editseq預測為32 ku。而在SDS-PAGE電泳時預染彩虹蛋白Marker顯示分子量約為36 ku，這是因為SDS-PAGE電泳時分子量Marker尤其是預染蛋白Marker，只是一個參考值，不能作為絕對標準。通常情況下，非預染蛋白Marker往往比預染蛋白Marker具有更準確的蛋白質分子量估算結果，這是因為預染蛋白marker為確保一致的遷移率，蛋白會帶有飽和標記的染料，可能會使蛋白的原始分子量和表觀分子量之間的差異增大。但預染蛋白marker在免疫印跡時可以評估蛋白轉印到膜上的效率和指示蛋白分子量。另外，電泳的行為受很多因素的影響，與蛋白的氨基酸組成、修飾情況密切相關，因此SDS-PAGE不一定能夠準確反映分子量的大小，尤其是有的蛋白易形成二聚體，還有一些比較難變性而又形成緊湊的球形結構的蛋白，在用常規方法電泳時會出現異常行為，表觀分子量與實際分子量不符。Abraham等在研究脊髓灰質炎病毒多肽SDS電泳遷移時發現，隨著分子半徑的變化，SDS結合增加，分子電荷增大，相對遷移速度加快，表觀分子量值降低，在SDS中加入尿素或者甲酰胺能使部分多肽的變性更完全、電泳動更快、表觀分子量降低[16]。例如，核糖核酸酶是一種低分子量的酸性蛋白質，它有3個二硫橋，這種蛋白質在某些情況下表現出異常的電泳行為，未還原蛋白的電泳遷移率與其分子質量大致對應，而還原蛋白的遷移則與蛋白質二聚體的預期分子質量一致，在某種條件下，該蛋白不結合SDS，其電泳遷移性僅由其靜電荷和水動力特性決定。因此理論分子量可以用軟件預測，應用分子篩可以得到準確的蛋白理論值。為了檢驗本試驗中表達的融合蛋白的特異性和正確性，試驗中利用融合蛋白的6-His標簽進行Western Blot，結果表明，彩虹蛋白Marker顯示表觀分子量約為36ku的蛋白正是所構建的融合蛋白。

3.3 原核表達系統

將外源基因克隆在含有lac啟動子的表達載體中，讓其在E.coli中表達，宿主菌起初生長時lacⅠ產生的阻遏蛋白與lac操縱基因結合，阻斷了外源基因的轉錄及表達，當向培養基中加入lac操縱子的誘導物IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖)，阻遏蛋白不再與操縱基因結合，使得外源基因得以大量轉錄并高效表達，未加IPTG誘導的菌株不能高效表達外源蛋白。本試驗SDS-PAGE電泳檢測時發現未加IPTG誘導的對照組有微弱的目的蛋白條帶，但Western Blot時沒有檢測到，推測表達菌株不加IPTG也可能會有極少量表達；但由于表達量低，結合的抗體少，致使Western免疫印跡未能檢出。

在溫度較低時誘導表達，蛋白質合成速率降低，多肽折疊的動力學會發生改變，可能會使蛋白正確折疊的比例增加，更有利于形成穩定的可溶性蛋白[17]。但本試驗中在27 ℃時誘導表達的融合蛋白表達量明顯低于37 ℃時的量，因此本試驗沒有驗證較低溫度時表達蛋白的可溶性，這還需進一步研究。

一般來說由于MHC基因具有高度的多態性，制備單克隆抗體具有篩選困難和效率低下的問題[18]，因此本試驗利用純化的重組蛋白免疫兔子制備了效價高且特異性強的多克隆抗體。

總之，本研究成功構建了西伯利亞鱘Pet30α-MHCⅡβ原核表達載體，并進行了結果鑒定，制備了兔多克隆抗體，為從蛋白水平研究MHCⅡβ的生物學功能和參與機體的免疫應答調控提供參考。