微納鋅對葡萄炭疽病菌和白腐病菌的抑菌效果

閆莉春，錢亞明，王西成，王壯偉，王 博，吳偉民

(江蘇省農業科學院果樹研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇南京 210094)

膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)是炭疽菌屬中最常見的復和種，是引起葡萄炭疽病的主要致病菌，并且炭疽病菌的寄主范圍十分廣泛，能夠侵染包括草莓、香蕉、木瓜、芒果、梨、蘋果等多種木本和草本植物的果實、葉片和枝條，引起果腐、葉斑和枝枯等[1-4]。膠孢炭疽菌危害葡萄時，主要危害著色期或近成熟期的果實，受害初期果粒上形成褐色圓形斑點，而后病斑擴展或融合形成大病斑，溫濕度高的條件下病斑長出粉紅色黏狀物，嚴重時病斑擴展至半個或整個果粒，引起果實腐爛脫落，嚴重影響葡萄品質和產量，對農業生產造成巨大的經濟損失[5-6]。白腐病病原菌[Coniothyriumdiplodiella(Speq.) Sacc]能引起葡萄白腐病，可危害葡萄穗軸、葉片和果實等。葡萄葉片發病時，多起始于葉尖或葉緣，起初葉邊緣成水漬狀，病斑逐漸擴展至葉片中部形成近圓形病斑，呈不同程度的同心輪紋狀，嚴重影響樹體長勢。葡萄白腐病危害果實時，首先從果梗基部發病，發病部位變成褐色軟腐狀，隨后果粒開始腐爛，發病嚴重時，常常使全穗腐爛，嚴重影響葡萄品質和產量，對葡萄產業造成巨大的經濟損失[7-9]。

由于缺乏有效的抗病品種，目前對葡萄炭疽病和白腐病的主要防治手段依然是噴施常用化學農藥，化學農藥的作用位點一般是單一靶標，隨著長期大量化學藥劑的使用，病原菌出現嚴重的抗藥性，使病害防治難度加大，防治效果降低[10-13]。因此，探索新型材料用于防控葡萄炭疽病和葡萄白腐病對科學防治病害具有重要的意義。近幾年，納米技術作為新興跨學科研究領域，在植物營養生長和植物保護等方面具有越來越廣闊的發展前景[14-15]。微納鋅是一種兼具微米級和納米級鋅粒子的新型抗菌材料，相比于傳統納米材料，速殺和持久抑菌的效果更加顯著。同時，鋅元素是植物生長和人體發育過程中必需的一種礦質元素，可參與植物的光合作用促進植物生長、促進其他微量元素的吸收、提高作物產量和品質，參與人體的免疫、內分泌和生殖遺傳等過程，對人體健康具有重要的調控功能[16-17]。因此微納鋅材料具備高度的安全認可，已在醫療、公共衛生消殺等領域應用。目前關于微納鋅對植物致病真菌的抑制作用等研究未見相關報道。因此，本研究將明確微納鋅對葡萄炭疽病菌和白腐病菌的抑菌效果，旨在為微納鋅用于田間防治葡萄病害提供理論依據，也為微納鋅用于防控其他作物病害提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試病原菌 葡萄炭疽病菌菌株RR-36、葡萄白腐病菌菌株WR-11保存于筆者所在實驗室，均由南京市溧水地區葡萄發病樣品中分離而來。

1.1.2 供試試劑 微納鋅原液由南京凱創協同納米技術生物有限公司提供。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基：稱取200 g馬鈴薯洗凈去皮并切成小塊，加水煮爛，用2層紗布過濾，加入20 g葡萄糖，15 g瓊脂，補足1 000 mL無菌水，分裝并高壓蒸汽滅菌后備用。

1.2 試驗時間

本試驗于2020年7—10月在江蘇省農業科學院果樹研究所分子生物學實驗室完成。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同濃度微納鋅培養基的制作 采用倍比稀釋法依次將微納鋅原液稀釋20倍(800 mg/L)、60倍(267 mg/L)、180倍(89 mg/L)、540倍(30 mg/L)、1 620倍 (10 mg/L)。將5 mL微納鋅原液加入到95 mL PDA培養基中配制成20倍稀釋的混合液，然后取60 mL分別倒入3個9 cm平皿中冷卻，將剩余30 mL加入60 mL PDA培養基，混勻后取60 mL倒入3個9 cm平皿中冷卻，按照倍比梯度稀釋法依次類推。

1.3.2 微納鋅對炭疽病菌和白腐病菌菌絲生長的抑制試驗 在上述含不同濃度的微納鋅PDA 培養基上，以不添加微納鋅作為對照組，分別接種 5 mm 的葡萄炭疽病病菌RR-36和白腐病病菌 WR-11 菌餅，將接種后的培養基置于26 ℃恒溫培養箱黑暗培養，直至空白對照組菌絲長滿培養皿。采用十字交叉法測量菌絲直徑。根據公式，抑制率=(對照組直徑-試驗組直徑/對照組直徑-菌餅直徑)×100%，計算各個濃度下微納鋅對膠孢炭疽菌和白腐病菌生長的抑制率。運用Excel軟件，以藥劑濃度的對數值為橫坐標(x)，藥劑對菌株生長的抑制率為縱坐標(y)，計算毒力回歸方程、相關系數(r)和有效抑制中濃度EC50值。

1.3.3 微納鋅對葡萄炭疽病菌孢子萌發的抑制作用

1.3.3.1 葡萄膠孢炭疽病菌RR-36孢子懸浮液的制備 取出保存于冰箱中的菌株RR-36，在超凈工作臺無菌條件下將菌絲塊集中于新鮮PDA培養基上，25 ℃恒溫培養箱中培養。待菌株RR-36產孢后，用無菌牙簽蘸取少量的粉紅色孢子于裝有1 mL無菌水的1.5 mL離心管中，10倍梯度稀釋后分別吸去少量孢子懸浮液于血球計數板上，在顯微鏡下統計孢子數量并計算孢子濃度，稀釋孢子懸浮液至5×105個/mL。

1.3.3.2 微納鋅對葡萄膠孢炭疽菌RR-36孢子萌發影響的測定 將微納鋅和孢子懸浮液混合制備成微納鋅終濃度為800、267、89、30、10 mg/L的混合液。每個處理取20 μL混合液，接種于凹玻片上，蓋上蓋玻片，將蓋玻片置于放有濾紙(已浸濕)的培養皿中26 ℃恒溫箱保濕培養，分別在0、6、12、18、24 h通過顯微鏡觀察并記錄視野內的萌發孢子數和總孢子數。每個濃度設3個重復，該試驗重復2次。根據公式：孢子萌發抑制率=1-(孢子萌發數/調查孢子總數) ×100%，計算不同處理下微納鋅對膠孢炭疽菌孢子萌發的抑制率。

2 結果與分析

2.1 微納鋅對葡萄白腐病菌菌絲生長的抑制作用

微納鋅對葡萄白腐病病菌菌絲生長有較強的抑制效果，隨著微納鋅濃度的提高，菌落直徑逐漸減小，對白腐病菌菌絲生長抑制作用越來越顯著。在微納鋅原液稀釋20倍(800 mg/L)、60倍(267 mg/L)時，菌絲生長完全受到抑制，在平板上可直接觀察到此濃度下白腐病菌不生長(圖1-A)。在稀釋180倍(89 mg/L)時，微納鋅對白腐病菌菌絲抑制率仍可達到56.49%(圖1-B)。通過計算得到微納鋅對白腐病菌菌絲抑制率的回歸方程為y=-66.794x+213.550，相關系數為0.982 1，模型擬合良好，EC50值為微納鋅稀釋281倍，濃度約為57 mg/L。

2.2 微納鋅對葡萄炭疽病菌菌絲生長的抑制作用

試驗結果顯示，在相同的培養條件下，用不同濃度的微納鋅(800、267、89、30、10 mg/L)處理葡萄炭疽病菌RR-36，微納鋅對葡萄炭疽病菌具有明顯的抑制作用，并且隨著濃度的升高，對葡萄炭疽病菌菌絲生長的抑制作用也越來越強，表明微納鋅材料的抗菌作用呈濃度依賴型。其中微納鋅稀釋20倍時(800 mg/L)對葡萄炭疽菌具有明顯的致死效應，導致葡萄炭疽菌無法在PDA平板上生長(圖2-A)。數據分析結果顯示，與對照組相比，稀釋60倍(267 mg/L)、180倍(89 mg/L)倍的微納鋅對葡萄炭疽菌菌落生長抑制率分別為65.80%、40.64%(圖2-B)。通過計算得到微納鋅對葡萄炭疽病菌的毒力回歸方程為y=-51.739x+161.390，相關系數為0.979 2，模型擬合良好，EC50值為微納鋅稀釋142倍，濃度約為113 mg/L。

2.3 微納鋅對葡萄炭疽病菌孢子萌發的影響

微納鋅可有效抑制葡萄炭疽病菌孢子萌發，培養24 h，對照組孢子全部萌發，而經濃度為800 mg/L(稀釋20倍)微納鋅處理的炭疽菌孢子完全不能萌發，濃度為267 mg/L(稀釋60倍)微納鋅處理的孢子幾乎不能萌發(圖3-A)。由圖3-B可知，濃度為800、267、89、30、10 mg/L的微納鋅對葡萄炭疽病菌孢子萌發抑制率依次為100.0%、88.0%、63.0%、48.0%、21.8%(圖3-B)。

3 討論與結論

葡萄炭疽病和白腐病是嚴重威脅葡萄生產的2種主要病害，已對葡萄產業造成嚴重的經濟損失。目前這2種病害的防控面臨著巨大的挑戰，已有研究表明，炭疽病菌和白腐病菌對多種藥劑產生了比較嚴重的抗藥性[10-12]。如果種植戶或農民在噴施農藥時操作不當，還會產生不同程度的藥害，嚴重影響葡萄品質。

目前，對殺菌劑/抗菌劑的研究主要包括有機、無機和天然抗菌3個方面，而金屬納米粒子因其具有顆粒尺寸小、表面積大和殺菌持久等優點，使其在抗真菌方面具有良好的效果[18-19]。已有眾多研究證明，納米材料對植物致病菌具有良好的抑菌效果，王連平等報道納米二氧化鈦能夠在一定程度上抑制炭疽菌生長和產孢[20]；管鵬證明100～800 μg/mL的納米氧化鎂都能較好地抑制膠孢炭疽菌菌絲生長和孢子萌發，并且提前施用400 μg/mL的納米氧化鎂表現出較好的柑橘炭疽病防治效果，表明納米氧化鎂具有作為植物保護劑的潛力[21]；甘智豪等證明納米銀對銅綠假單胞菌、綠膿桿菌等部分細菌和霉菌有較強的抑制效果[22]；游雨欣等用菌絲生長速率法證明了納米氫氧化鎂對茶輪班病病原菌擬盤多毛孢有較好的抑菌效果[23]。

目前，無機抗菌應用比較廣泛的元素包括銀、銅和鋅等，但納米銀和納米銅都因有一定的毒性而被限制使用范圍，而鋅元素是人體必須的微量元素之一，具有促進人體生長發育、維持正常食欲、增強免疫力和促進傷口愈合等多種重要功能，同時也是植物生長發育過程的營養元素，可融合產品廣泛，具有高度的安全認可[24-26]。納米鋅雖具有較高的安全性，但是抑菌效果卻遠不如納米銀等材料，因此開發出同時具備高安全性和較強抑菌效果的新材料迫在眉睫[27]。微納鋅是一種同時含有微米級和納米級鋅元素的新型復合材料，相比于納米鋅，速殺和持久抑菌的功能顯著增強。根據南京市疾控中心和廣東省微生物分析檢測中心出具的檢測報告，微納鋅對白色念珠菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌等多種有害病原物均具有較好的抑菌和殺菌效果。

本研究明確了微納鋅對植物致病真菌葡萄白腐病菌和炭疽病菌的抑菌效果，研究結果表明，微納鋅在濃度為800 mg/L時對白腐病菌和炭疽病菌具有致死作用，導致2種病原菌均無法在含藥PDA平板上生長；在濃度為89 mg/L時對葡萄白腐病菌、炭疽病菌的抑制率仍可達56.49%、40.64%；本研究結果表明，微納鋅可有效抑制葡萄膠孢炭疽菌孢子萌發，在濃度為267、89 mg/L時對炭疽病菌孢子萌發抑制率分別達88.0%、63.0%。綜合以上結果，在室內生物測定條件下，微納鋅對葡萄白腐病菌和炭疽病菌抑制效果顯著，為其在生產上用于防控葡萄真菌病害提供了理論依據，為葡萄產業綠色優質發展提供有力的技術支撐，還為微納鋅在防控其他果樹和農作物病害等方面提供了借鑒。