食品中單增李斯特菌檢驗技術(shù)研究進展

敖威華，李菁雯，陳林軍，趙治國，劉丹，崔強*

1. 呼和浩特海關(guān)技術(shù)中心（呼和浩特 010020）；2. 二連海關(guān)技術(shù)中心（二連浩特 021600）

隨著生活水平的大幅提高，人們對食品質(zhì)量的要求也越來越高。食品質(zhì)量在人們生活中所占比重逐步增加。打造質(zhì)量強國戰(zhàn)略，食品行業(yè)在快速發(fā)展，規(guī)模也在不斷地擴大，而在發(fā)展過程中，食品安全問題也在逐年增加，尤其是食源性病原微生物的頻發(fā)，嚴重威脅我國食品行業(yè)的發(fā)展。微生物檢驗作為一項重要的技術(shù)手段，為保障食品安全提供強有力的科學(xué)依據(jù)。我國對于食品中單增李斯特菌的檢測和鑒定仍停留在傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、鑒定和血清型等GB 4789.30—2016《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》描述的檢測方法上。現(xiàn)有檢測方法通常是培養(yǎng)法，但采用該方法也有很多的弊端，如檢測靈敏度不高，對目標菌和雜菌的檢測容易漏檢，此外對于檢測結(jié)果中菌類計數(shù)會因不同檢測人員不同的計數(shù)方法會有差異。這些方法不僅需要時間長、操作繁瑣，而且特異性不強、靈敏度也不高。因此，從食品安全現(xiàn)狀和食品微生物檢測技術(shù)等關(guān)鍵問題出發(fā)，建立符合我國國情的食品安全檢測體系，可有效控制和預(yù)防食源性致病菌的傳播、發(fā)展。

食品微生物檢驗技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用成為大勢所趨，尤其是食品安全檢測部門更加注重其發(fā)展?jié)撃堋Ｊ称肺⑸餀z測方法為食品的安全提供強有力的科學(xué)依據(jù)。食品微生物的檢測關(guān)系著食品的安全，而食品安全又關(guān)系著人體健康。因此，食品微生物檢測是關(guān)乎食品安全的關(guān)鍵因素。食品中單增李斯特菌的檢測是衡量食品衛(wèi)生與安全的重要指標之一，也是判定被檢食品能否適用的科學(xué)依據(jù)之一；通過食品中單增李斯特菌的檢測，可以判斷食品加工環(huán)境及衛(wèi)生情況，對食品被致病微生物污染的程度作出正確的評價，為各項食品安全管理工作提供科學(xué)依據(jù)；對食品微生物檢驗可有效預(yù)防或減少食物中毒和人畜共患病的發(fā)生；對提高產(chǎn)品質(zhì)量、避免經(jīng)濟損失、保證出口等方面在政治和經(jīng)濟上都具有重大意義。

1 微生物檢測的常規(guī)方法

多年來，對于食品中單增李斯特菌的檢測通常采用GB 4789.30—2016《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》中的平板培養(yǎng)法，該方法不僅耗時長，而且容易造成結(jié)果數(shù)據(jù)的誤差，從而影響試驗結(jié)果。近幾年，檢驗檢測機構(gòu)致力于快速檢測技術(shù)和方法的研究，以提高食品中單增李斯特菌檢測的準確性和可靠性，其中的常規(guī)新方法有以下幾種。

1.1 顯色培養(yǎng)基技術(shù)

顯色培養(yǎng)基微生物快速檢驗技術(shù)是指借助于微生物所對應(yīng)的種屬特異酶，在培養(yǎng)基中加入與之對應(yīng)的顯色酶，在微生物生長代謝過程中產(chǎn)生酶，發(fā)揮對底物的水解效果，從而對培養(yǎng)物進行著色，實現(xiàn)對微生物的準確鑒定。法國研究人員于1974年首次開發(fā)顯色培養(yǎng)基，并將其應(yīng)用于對大腸桿菌的檢驗中，后期應(yīng)用范圍不斷擴展，價值日益凸顯。顯色培養(yǎng)基已被應(yīng)用于對單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、志賀菌等快速檢測過程中，檢測人員可以根據(jù)不同菌群在不同的顯色培養(yǎng)基的顯色效果，可快速檢測，判定該菌群種類。此外，根據(jù)著色的差異還有快速紙片法，在單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌等微生物的檢測中具有快速、準確的優(yōu)勢。

1.2 電阻抗法

電阻抗法是近年來發(fā)展起來的一項生物學(xué)技術(shù)。電阻抗法的技術(shù)原理是細菌在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)生長繁殖的過程中，導(dǎo)致培養(yǎng)基中大分子電惰性物質(zhì)如碳水化合物、蛋白質(zhì)等代謝為活性小分子物質(zhì)，從而增強瓊脂培養(yǎng)基的導(dǎo)電性，改變培養(yǎng)基的電阻抗，通過檢測電阻抗來判定培養(yǎng)基中細菌的生長繁殖情況[1]，判定細菌在瓊脂培養(yǎng)基中的生長繁殖特性，即可檢測出相應(yīng)的細菌。該方法已被用于單增李斯特菌、菌落總數(shù)、霉菌、酵母菌、大腸桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌等病原微生物的檢測[2]。

1.3 免疫磁珠的分離方法檢測

陽性分離法磁珠結(jié)合的細胞即為所要分離獲得的細胞，而陰性分離法磁珠結(jié)合不需要獲得的細胞，游離于磁場的細胞為所需細胞，采用免疫磁珠的分離方式，將特異性抗體與磁珠顆粒的表面進行關(guān)聯(lián)，可將樣品中的微生物進行特異性結(jié)合，通過外部磁場的作用，裝有病毒的微生物磁珠會在其作用之下向兩端靠攏，可使微生物從樣品中分離出來。這種方法相對于普通檢測方法而言，可以在含有大量細菌的溶液中，選擇性地將微生物分離出來，具有較高的檢出效率[3]。一般來說，陰性磁珠分離法比陽性分離法用的磁珠多，因此選擇陽性磁珠分離的方法較多。但該方法會對細胞造成機械壓力，影響其生物學(xué)活性，不利于細菌分離后的培養(yǎng)，而且成本較高，操作較為繁瑣，不利于在實驗室進行微生物的快速檢測。

1.4 納米裝置

納米裝置就是根據(jù)納米粒子的特性，把納米粒子用于標記物檢測裝置。當物體的尺度小到納米尺度時，就會表現(xiàn)出與宏觀尺度物質(zhì)不同的性能，因此稱為納米效應(yīng)。納米效應(yīng)可作為生物分析標記物質(zhì)，能夠極大地改善標記物性能，顯著提升靈敏度[4]。雖然該方法檢測的試驗數(shù)據(jù)靈敏度高、特異性較強，但就目前檢測實驗室的整體情況而言，該方法在應(yīng)用上還有較大難度。

2 微生物檢測的分子生物學(xué)技術(shù)

分子生物學(xué)技術(shù)是一種現(xiàn)代新型的分子技術(shù)，在食品微生物檢測過程中，主要是在分子水平上分析微生物的線性結(jié)構(gòu)以認知樣本中的微生物類型，其主要優(yōu)點是特異性強、靈敏度高。Liu-Stratton等[5]證實分子生物學(xué)技術(shù)在食品檢測中應(yīng)用廣泛，分子生物學(xué)檢測與基因的表達對食品檢測具有重要意義。

2.1 可視化基因芯片技術(shù)

基因芯片以其高靈敏度、高通量的特點逐漸成為致病微生物檢測研究的熱點，對于普通的基因芯片在雜交反應(yīng)結(jié)束后還需使用熒光掃描顯微鏡對結(jié)果進行分析，給實驗室在使用上造成一定困難。為解決基因芯片試驗結(jié)果處理與分析的難題，開發(fā)一種新的芯片技術(shù)——可視化基因芯片技術(shù)。Ostroff等[6]證實酶在催化作用下產(chǎn)生沉淀，并沉積于基因芯片表面，使基因芯片的厚度發(fā)生明顯的變化，導(dǎo)致反射在基因芯片上光的波長發(fā)生實質(zhì)改變，通過基因芯片上顏色的變化來觀察試驗結(jié)果。可視化基因芯片技術(shù)檢測效率高，操作方便快捷，能夠在較短時間內(nèi)得出檢測結(jié)果，雖然一次可視芯片技術(shù)檢測能夠檢測出多種潛在致病菌，但是由于可視化基因芯片檢測技術(shù)成本較高，操作要求比較繁瑣，因此，未在食品安全領(lǐng)域有較多推廣[7]。

2.2 熒光標記噬菌體技術(shù)

熒光標記噬菌體技術(shù)是根據(jù)噬菌體特異性侵染宿主菌的原理，選用合適的染色劑將噬菌體的核酸進行染色標記，用標記過的噬菌體侵染相應(yīng)的宿主菌，噬菌體吸附在其宿主菌表面后，隨即將標記過的核酸注入宿主細胞，隨著越來越多的噬菌體核酸的注入，細胞內(nèi)熒光隨著熒光素的增多而增強，借助熒光顯微鏡便能判定宿主菌的存在，從而實現(xiàn)病原菌的檢測[8]。Mosier-Boss等[9]在前人基礎(chǔ)上，將熒光染料YOYO-1更換為靈敏度較高，且對噬菌體結(jié)構(gòu)和功能都無破壞性的SYBR gold核酸染料標記沙門菌噬菌體P22，成功檢測到沙門菌LT2株，同時與核酸染料作對比，結(jié)果顯示SYBR gold染劑是試驗效果最好的核酸染料；Phea等[10]與Flajshans等[11]分別將SYBR greenⅠ和SYBR green Ⅱ用于單增李斯特菌、大腸桿菌及沙門菌的檢測，均成功檢出，且靈敏度較高，特異性強，該方法完全可用于實際生產(chǎn)中微生物的檢測。多數(shù)噬菌體與宿主呈一一對應(yīng)關(guān)系，雖特異性極高，但宿主范圍較窄，且噬菌體與宿主作用的裂解機理尚不明確，有待進一步研究，所以該技術(shù)在實踐中的應(yīng)用相對較少。但是熒光標記噬菌體技術(shù)，檢測周期短，能區(qū)分死活細菌，準確性好，檢測前無需將細菌純化，預(yù)增菌后即可用于檢測，整個過程可在8 h內(nèi)結(jié)束，且可以對多個細菌進行同步檢測，因此該項技術(shù)在食源性致病菌的檢測中有廣闊的發(fā)展前景。

2.3 熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）

熒光定量PCR技術(shù)是1996年由美國Applied Biosystems公司推出的一種新的定量檢測技術(shù)，通過熒光染料或熒光標記的特異性探針，對PCR的產(chǎn)物進行標記，使用熒光定量PCR儀對圖示結(jié)果進行分析，計算出待檢樣品的初始濃度[12]。Cheng等[13]利用設(shè)計的引物和探針檢測沙門菌的262 bp基因片段，Bialek等[14]熒光定量PCR-探針法分析藥物分子含量。熒光定量PCR技術(shù)根據(jù)已知細菌的遺傳信息，設(shè)計特定的引物探針擴增序列，根據(jù)是否有特定長度擴增產(chǎn)物的出現(xiàn)判斷是否存在檢測的目標細菌[15]。該方法用于微生物及病原菌毒素檢測具有快速、靈敏、特異性強等優(yōu)點[16]。此外熒光定量PCR技術(shù)可實現(xiàn)多通道、多項目的檢測，在食品中單增李斯特菌等致病菌檢測中發(fā)揮重要作用。

2.4 基因探針技術(shù)

生物技術(shù)用于食品檢測是十分常見的技術(shù)手段，尤其是一些富含大量微生物的食品，如在酸奶、乳酸菌飲料中含有大量對人體有益的菌類，如何正確區(qū)分有益菌和致病菌，只有依靠生物技術(shù)才能實現(xiàn)。基因探針技術(shù)在這一點上表現(xiàn)得十分出色，能準確地檢測出食品中的菌類[17]。基因探針技術(shù)是用一段已知基因的核酸序列作為探針，與變性后的單鏈基因組DNA接觸時，若兩者的堿基完全配對，可互補結(jié)合成雙鏈，表明被測基因組DNA中含有已知的基因序列。該技術(shù)具有特殊性強、靈活性高、操縱便捷、省時等優(yōu)勢。但該技術(shù)也有局限性，主要體現(xiàn)在成本高等方面。

2.5 微滴數(shù)字PCR技術(shù)（micro drop digital polymerase chain reaction，ddPCR）

微滴數(shù)字PCR擴增前是將一個大的反應(yīng)體系進行微滴化處理，利用油包水技術(shù)將其“分割”為數(shù)萬個納升級的微滴[18]，每個微滴或不含待檢核酸靶分子，或含有至少一個待檢核酸靶分子，并且每個微滴都是一個獨立的PCR反應(yīng)體系。根據(jù)陽性微滴的個數(shù)與比例，利用泊松分布原理得出靶分子的起始拷貝數(shù)，從而實現(xiàn)對最初反應(yīng)體系中核酸靶分子數(shù)的絕對定量[19]。該方法在傳統(tǒng)的PCR擴增前將含有核酸分子的反應(yīng)體系進行有效分割，通過PCR擴增和熒光信號的積累讀取陽性反應(yīng)單元數(shù)，計算出檢測樣本的DNA分子數(shù)目[20]。由于ddPCR技術(shù)降低了對反應(yīng)擴增效率的要求，可以有效勝任許多稀有變異的檢測工作。ddPCR技術(shù)采用一種全新的方式進行核酸分子的定量，與傳統(tǒng)的普通PCR和熒光定量PCR相比，其結(jié)果的精確度、準確性和靈敏度更佳。ddPCR技術(shù)比傳統(tǒng)的熒光定量PCR方法更加準確，特異性更強，靈敏度更高，能夠做到絕對定量。該技術(shù)在微生物檢測、轉(zhuǎn)基因檢測、地溝油檢測、動物疫病檢測、疾病檢測以及質(zhì)檢領(lǐng)域的研究和應(yīng)用中已凸顯優(yōu)勢，隨著微滴數(shù)字PCR儀的普及應(yīng)用，該技術(shù)必將被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個領(lǐng)域。

2.6 疊氮溴化乙錠-聚合酶鏈式反應(yīng)（ethidium monoazide bromide-polymerase chain reaction，EMA-PCR）檢測技術(shù)

將EMA與熒光定量PCR技術(shù)相結(jié)合，能夠有效、快速地檢測出食品中的食源性致病菌，而且EMA作為DNA結(jié)合染料，能夠快速滲透細胞壁，穿透細菌的細胞膜，從而進入細胞體內(nèi)。通常死細胞的細胞膜已遭到破壞，EMA很容易滲透到細胞內(nèi)部，插入到細胞內(nèi)DNA雙螺旋上。但活菌的細胞膜比較完整，EMA不能滲透到活細胞內(nèi)。選用一定濃度比例的EMA與菌液結(jié)合，經(jīng)過高強度的鎢燈照射處理，插入到DNA雙螺旋上的EMA能夠與DNA雙螺旋發(fā)生共價交叉偶合，且這種共價偶合具有不可逆性，抑制后續(xù)PCR擴增中引物與死菌DNA的結(jié)合，從而達到區(qū)分死活菌的目的[21]。該方法的建立能夠快速、準確地區(qū)分、鑒定死菌和活菌，與普通PCR方法比較，大幅降低假陽性結(jié)果。該方法具有檢測結(jié)果準確、檢測周期短、靈敏度高等特點，在食品中單增李斯特菌等致病菌微生物檢測領(lǐng)域應(yīng)用前景廣泛。

3 結(jié)語與展望

從分子學(xué)角度來看，單增李斯特菌檢測技術(shù)的發(fā)展從普通的培養(yǎng)基培養(yǎng)法，再到后來的PCR技術(shù)、熒光定量PCR方法和絕對定量PCR技術(shù)，實現(xiàn)微生物檢測從定性到絕對定量的質(zhì)的發(fā)展。微滴式數(shù)字PCR技術(shù)是近年來發(fā)展起來的絕對定量技術(shù)，該方法是在PCR擴增前將含有核酸分子的反應(yīng)體系進行有效分割，微滴式數(shù)字PCR技術(shù)的定量檢測限比傳統(tǒng)PCR技術(shù)低，特異性、重復(fù)性和傳統(tǒng)定量PCR也存在極大的優(yōu)勢。鑒于這種微滴反應(yīng)能極大程度分散反應(yīng)體系，可以有效消除抑制因子的作用，保證檢測過程中的擴增效率，對檢測低含量目標核酸分子的樣品有良好的效果[22]。因此，在微生物檢測與研究中，可將EMA與微滴式數(shù)字PCR技術(shù)相結(jié)合，用于活體微生物的檢測，運用其絕對定量檢測的優(yōu)點，應(yīng)用在日常的微生物檢測過程，其與常規(guī)PCR檢測技術(shù)相比最大的不同就是當檢測相同樣品數(shù)量時，運用EMA與微滴式數(shù)字PCR技術(shù)檢測的時間短、靈敏度高，而且能夠做到絕對定量。

食品安全問題與人體生命健康緊密相關(guān)，分子生物學(xué)技術(shù)能夠快速、準確地檢驗食品微生物數(shù)量和種類，是評價食品是否合格的重要標志之一，對促進食品行業(yè)的快速發(fā)展、提升食品安全質(zhì)量具有重要的現(xiàn)實意義。因此，應(yīng)加大對食品微生物檢驗技術(shù)的投入，使食品質(zhì)量更加安全可靠。運用簡便、快捷的分子生物學(xué)方法不僅可以在食品微生物檢測過程中提高檢出率，而且在人畜共患病的診斷等方面也有廣闊應(yīng)用前景。