動物病毒分離培養技術研究進展

吳通奎，包濤濤，黃功明，汪忠榮，莫興虎

黔東南州動物疫病預防控制中心，貴州凱里 556000

眾所周知，病毒是一種缺乏完整細胞結構及獨立完整酶系統的特殊結構，這也使得病毒不能在沒有生命的培養基中單獨生長，僅能依靠在活的組織細胞內生長繁殖。動物試驗，雞胚接種與細胞培養是3 種較為傳統且經典常用的病毒分離方法。研究者通過以上方法分離出了很多不同種類的病毒，當然也從不同方面分別對病毒的生長周期，宿主的免疫應答等做了前期試驗研究，為當代病毒學的科學研究打下了前期基礎。但隨著病毒變異頻繁性、新發病毒的突發性及一些較難培養病毒的特殊性，使我們在研究領域遇到了很多疑難雜癥，這也導致我們在病毒的深入研究中受到了一定的限制。本文分別從病毒傳統的分離培養技術及近年來探索發現的一些新技術做一論述，旨在為病毒的深入研究提供一定參考依據。

1 傳統的病毒分離培養技術

1.1 動物試驗

動物試驗是在病毒分離培養中的一種較為常用且經典的實驗方法，通過使用這種方法一方面可以適用于大多病毒的分離培養和測定動物敏感范圍，另一方面還能將其用于鑒定病毒和分析不同毒株之間的抗原關系等。除了以上用途外，實驗動物還能用于病毒的保存和弱毒株的復壯，及生產大量的動物組織疫苗等。同種及異種動物是動物實驗中所必要的兩種實驗動物類型，對于同種動物來說，我們在實驗前應先進行血清學檢查，經抗體檢測合格后方能使用，以確保所選擇的實驗動物是合格的。小白鼠、大鼠及個體較小的豬只等是我們實驗過程通常選擇的異種動物類型。在我們選擇動物開展試驗時，要盡可能保證動物是健康的且品種是純凈的。根據病毒的特性不同，優先選用敏感性高的實驗動物，盡量采取不同的接種方式進行接種。此外，在實驗過程中還需考慮多做幾個重復實驗，以便增加試驗數據的說服力。同時必須嚴格設立對照組，盡量避免因動物的個體差異而導致實驗結果不成立。最后，在操作過程的每一環節必須保證無菌操作，若無法確定實驗條件是否達到無菌狀態，可將青、鏈霉素按要求制作成雙抗混懸液，按一定比例加入至接種液中，再對實驗動物進行免疫接種。

1.2 雞胚培養

許多病毒尤其是禽源病毒幾乎都能在雞胚中進行增殖，利用雞胚可以進行病毒分離鑒定、抗原制備及疫苗生產等。除雞胚外，鵝胚和鴨胚也能用于個別病毒的增殖。通常應選擇無病雞群中新鮮、潔凈及受精率較高的（90%以上）SPF 種蛋，以白殼蛋最佳，因其顏色單一且照蛋時也便于操作者觀察。雞胚孵化器溫度一般控制在37.5 ～38 ℃，濕度控制在60%～65%左右，翻蛋頻率保持在3 次/d 以上。在前期翻蛋時應先將蛋進行橫放，在試驗接種前2 天再改為豎放，操作過程還要特別注意雞胚位置，以接近蛋盤中間為宜，不要過于偏向一側。孵化過程還需進行專人管理，遇到故障時及時維修，避免造成不必要損失。接種前照蛋，應嚴格區分出活胚與死胚，活胚血管分支十分明顯呈鮮紅色，胚胎能夠自由移動，死胚血管模糊不清或有時呈暗紅色，我們應該選擇活胚進行接種。一般選擇9 ～11日齡雞胚用于接種，某些特殊病毒則需根據其特性而選擇特定日齡雞胚。根據不同病毒增殖特點可選擇不同接種方式，常見接種方式主要有絨毛尿囊膜接種，尿囊腔接種、羊膜腔及卵黃囊接種等。與此同時，我們在接種時還需保證接種環節的無菌，如通常可先在蛋殼上使用碘酒擦拭消毒3 ～5 次，然后再使用酒精進行脫碘操作，接種后的雞胚使用石蠟進行封閉針孔。

1.3 細胞培養

細胞培養技術在病毒研究領域應用十分廣泛，不僅能用作病毒的分離培養，還能用作病毒繁殖過程及細胞敏感性的相關研究。

1.3.1 原代培養

無菌采集動物組織并剪碎，先經胰酶消化獲得單細胞懸液，再將其轉至培養皿中培養。實踐中雞胚成纖維細胞、鴨胚成纖維細胞及犢牛睪丸細胞等均常用于不同病毒的分離。

1.3.2 二倍體細胞培養

將原代單層細胞消化分散為單個細胞懸液，繼續培養傳代仍為二倍體，這種細胞數量可擴大，對病毒易感性一般影響不大，從樣本中分離培養病毒，通常使用這種細胞進行培養。

1.3.3 傳代細胞培養

在體外培養液中可無限制分裂傳代的細胞，一般來源于腫瘤組織。研究者們已成功建立了多種傳代細胞系，如非洲綠猴腎細胞(Vero)、猴腎上皮樣細胞(Mark-145)、豬睪丸細胞(ST)及豬腎細胞 (PK-15)等細胞系。傳代細胞培養較為方便且使用也較為廣泛，但其也有弊端，如對某些病毒不敏感，傳代時間長及易被支原體污染或病毒隱性感染，也存在致腫瘤的潛在危險。傳統細胞病毒分離方法固然有效，但是耗時長、效率低及易污染這是不可否認的。近幾年，隨著科學技術的快速發展，出現了很多細胞培養的改良方法，如離心培養、混合培養及轉基因培養等試驗技術，這些技術使得病毒分離培養在時間及效率上得到了極大程度的改善。

2 病毒分離培養新技術研究進展

2.1 “木筏式”培養

這種方式是一種將上皮細胞置于“氣－液”兩相介質中進行培養，就猶如木筏在空氣和水面之間，故又形象地將這種培養方式稱為“木筏式”培養。該方式可以使細胞高效生長并快速分化，對于接近自然狀態下宿主組織的原代呼吸道上皮細胞就是一種培養模型，研究者們正是利用它能模擬出呼吸道生理環境的這種獨有特點，才建立起了各種呼吸道病毒的復制及其病理機制的多種研究模型。

2.2 基質培養模型

3D 基質培養模型，是一種既能支持細胞的復制分化，又能為細胞模擬出體內生存微環境的培養體系。近年來關于基質培養模型的報道不斷增加，其中人工基底膜培養體系便是其中一種。人工基底膜是一種膠狀的蛋白混合物，通常可以將其用作支架，以盡可能地模擬出體內復雜的3D 細胞外環境。研究表明，使用這種模型進行培養能夠很好地解決自然狀態下病毒的感染和復制問題。

2.3 旋轉壁式生物反應器培養模型

旋轉壁式生物反應器（RWVB），一種最初由美國人設計并用于模擬太空微重力的特殊設備，具有可以精確模擬機體組織的內部環境特點。研究者們正是利用RWVB 的這種優勢，將其成功改裝成了一種新型的細胞培養裝置。該裝置是一種內部充滿液體的圓柱體旋轉裝置，操作者可以根據細胞的種類、特性及培養物的大小對該培養裝置的轉速進行自動調節，以確保培養物可以在長時間內保持懸浮的狀態。使用RWVB 培養的細胞具有一定空間自由度，這種自由度對細胞與細胞，細胞與基質之間的接觸也是非常有利的，因為它能重現細胞極性，也能模擬出體內組織的真實環境，這些因素對于病毒與宿主之間的相互作用機制的研究也是非常重要的。此外，與傳統細胞培養方式相比，由RWVB 培養的細胞對病毒具有更強的抵抗力，同時其也能產生更多的感染性病毒顆粒，病毒顆粒的增加從另一方面也表明使用RWVB 方式培養能夠更好地模擬出體內環境。

2.4 干細胞來源細胞培養

對于某些培養較為困難的病毒來說，選擇敏感性高的細胞做原代細胞培養通常為首選。然而采用原代細胞培養也可能會因個體差異而對實驗結果產生不同影響，針對這種情況目前尚無成熟可行的評價體系，同時其培養方式是一種細胞在體外環境中單獨生長，也存在不能長時間培養的局限性，這一點也是不容忽視的。當前已有很多使用干細胞來源的培養方式培養分化為相應的敏感細胞并用于病毒培養的相關報道。總的來說，與其他方法相比，干細胞來源的細胞培養在體外培養的時間可以達到更長，也能長時間的維持細胞的特異性表型，同時還能高度表達與病毒感染復制的相關因子，對于病毒與宿主之間作用的研究也非常適合。

3 小結

隨著世界醫學水平的快速發展，用于檢測各種病毒的方法也隨之不斷更新，如分子生物核酸探針檢測技術和免疫學方法檢測技術等。分子生物學相關檢測方法，因憑借其操作方便、靈敏度高等優勢在疾病檢測中得到了廣泛應用。但一直被作為病毒鑒定“金標準”-病毒分離培養法，仍存在靈敏度低、耗時、耗力等缺點。隨著生物學技術的快速發展，傳統病毒分離培養的相關技術也與時俱進得到了各種新的進步，也彌補了之前的短板與不足，同時也提高了傳統分離方法的實用性。而后期研究的立體細胞培養技術一方面可以提高病毒分離的效率及靈敏度，另一方面也為一些培養及分離困難的病毒提供了新的研發思路，這些技術在病毒分離、感染、病毒與宿主相互作用等方面的研究具有較好的應用前景。