番木瓜轉錄組學研究進展*

陳 燕，鄭 劍，余江敏，歐景莉，陳仕淼，何 江，黃雪梅，彭靖茹，朱楊帆，周俊岸，陳豪軍，潘祖建

（1 廣西壯族自治區亞熱帶作物研究所，南寧530001）（2 廣西農業職業技術大學）

番木瓜（Carica papayaL.）是番木瓜科番木瓜屬多年生草本果樹，在我國廣東、廣西、海南、福建、臺灣、云南等省區都有種植[1]。番木瓜果實可鮮食、可做菜，木瓜干絲可做成醬菜，木瓜蛋白酶可廣泛應用于食品、醫藥、護膚品等行業，由于種植當年可見收益，具有廣闊的發展前景。近年來，受花葉病、枯萎病等的影響，番木瓜產業遭遇瓶頸。通過組培技術培育健康種苗、了解番木瓜抗病機制、培育高產優質品種對番木瓜產業的發展具有重要的理論和實踐指導意義。

轉錄組廣義上是指某一生理條件下，細胞內所有轉錄產物的集合，包括信使RNA、核糖體RNA、轉運RNA 及非編碼RNA；狹義上指所有mRNA 的集合，可以反映不同生理狀況、不同生命階段及環境條件下基因的表達情況[2]，目前轉錄組測序技術已經得到廣泛的應用[3]。利用轉錄組學技術對番木瓜進行研究，可為了解抗逆抗病機制及選育高產優質品種提供分子依據。本文對番木瓜在不同方面的轉錄組研究進行總結和概況，以期對番木瓜的進一步研究和轉錄組測序的應用提供參考。

1 番木瓜組培的轉錄組研究

番木瓜的傳統育種方式為雜交育種，用實生苗進行繁殖，有優勢也有不利因素，優勢在于簡單易操作，易獲得變異植株，選育新品種，但是由于番木瓜植株根據性別可分為雌株、雄株、兩性株[4]，實生苗不能保證獲得性別一致的植株，只有兩性株具有較高的經濟價值，如遇到數量較多的雄株，則會影響當年收益[5]，且實生苗沒有進行脫毒，容易被花葉病危害，造成減產減收[6]。組培苗相對于實生苗，單株價格較高，但也有其優勢，可獲得株性一致、株型相同的植株，且繁殖速度快，不受季節影響，用莖尖培養可獲得無病毒植株，植株長勢及果實品質好，商業價值高。從1974 年首次報道用番木瓜葉柄作為外植體誘導，獲得愈傷組織，并培養出體細胞胚至今，國內外番木瓜組培技術已日趨成熟[7-12]。隨著轉錄組學技術的發展，通過轉錄組研究分析探討組培過程中的分子調控機制也隨之跟進。Zhao 等[13]發現，CpLBD19和CpESR12 個基因在愈傷組織誘導培養基和不定芽誘導培養基上發生了突變，可作為番木瓜愈傷組織誘導和不定芽形成的指標。番木瓜胚性愈傷組織中表達的基因也被發現，如體細胞胚胎發生相關基因有SERK和LEA、生長調節劑相關基因、應激相關基因和次生代謝產物生物合成途徑相關基因，在胚性愈傷組織中表達了NAC、WRKY、MYB、WUSCHEL、Agamous-like MADS-box蛋白和bHLH等重要的轉錄因子[14]。

一些不利于愈傷組織形成的條件和因素也得到了研究，如Jamaluddin 等[15]研究了DET1基因抑制對番木瓜胚性愈傷組織的影響，發現差異表達基因主要參與苯丙素類生物合成和應激反應、發育過程、脂質代謝和對各種刺激的反應。Zhou 等[16]發現，根誘導培養基中添加瓊脂和吲哚-3-丁酸（IBA）莖接種外植體不定根的形成受到限制，差異基因參與了厭氧呼吸和活性氧（ROS）代謝途徑，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性和過氧化氫（H2O2）濃度升高。

轉錄組學的研究為揭示胚性愈傷組織誘導的早期生物學過程及建立高效的番木瓜離體繁殖生根體系提供了依據。

2 番木瓜性別分化的轉錄組研究

番木瓜株性、花性復雜，隨著溫度的變化，花性會有所改變，性別分化可能是由植物生長調節劑（尤其是脫落酸和生長素）、脂類代謝途徑及光合作用等轉錄、表觀遺傳生物過程共同調控[17-18]，miR394 可能是調控番木瓜性別的重要因子[19]，CpSVPL、CpSERK和CpCAF1AL為性別相關基因，且編碼區存在性別相關單核苷酸多態性（SNPs）[20]，CpMS1基因在雄性和兩性花發育過程中高度上調[21]。Urasaki 等[22]發現性染色體上的大部分標記位于X 染色體上，通常只有30 個標記同時定位在X 和Yh 染色體上，在候選的Yh 染色體特異性雌性決定基因中篩選出1 個MADS-box基因。不同發育時期，雌性和兩性體細胞的差異表達基因不一致，同一性別胚胎發育過程中，基因表達的關鍵節點在心形胚階段和魚雷階段，胚胎發育候選基因為Cp49[23]。Zhou等[24]研究發現，雄性番木瓜在春季開花較早，這一現象可能與CpSVP和CpAP1的轉錄變化及其基因特異性低甲基化有關。低溫誘導后，雄花出現性別逆轉，可能是由表觀沉默雌蕊抑制因子的表達造成，并通過生長調節劑信號轉導、轉錄因子及Small RNA 和組蛋白甲基化調控來實現的[25-26]。

3 番木瓜逆境脅迫的轉錄組研究

由于番木瓜商業品種表現出對干旱脅迫的敏感性，因此對番木瓜的逆境脅迫研究主要集中在干旱脅迫。Estrella-Maldonado 等[27]用轉錄組（RNA-Seq）方法分析易受水分虧缺和耐水分虧缺的番木瓜樣本，共有29 070 條序列被鑒定為代表番木瓜轉錄組的基因，為進一步了解番木瓜克服水分虧缺脅迫的分子機制提供了有價值的信息來源。和干旱脅迫相關的一些基因也已找到，如CpHSF、CpMYB、CpN AC、CpNFY-A、CpERF、CpWRKY和CpDHN[28-29]。植株的不同部位在感受到不同的干旱程度時，表現出的反應也不一致，在中度干旱脅迫下，葉片和汁液中與細胞周期和DNA 修復相關的過程均上調；而根系對非生物脅迫的響應、生長調節劑信號傳導、蔗糖代謝和蘇木素合成均上調。在嚴重干旱脅迫下，所有組織中與非生物脅迫、生長調節劑信號和氧化還原相關的生物學過程都被上調[30]。對干旱脅迫的研究，響應干旱脅迫基因的發現有助于改良這一作物適應干旱的能力。

4 番木瓜病害的轉錄組研究

番木瓜環斑花葉病（PRSV）、番木瓜畸形花葉病（PLDMV）是影響番木瓜生產的主要病害，轉基因方法及藥劑防治等是預防病害的有效途徑。通過對抗PRSV 轉基因番木瓜及感PRSV 番木瓜進行轉錄組測序發現，許多與轉錄因子、轉運體和生長調節劑生物合成相關的差異表達基因（DEGs）在轉基因番木瓜中上調，逆境誘導和抗病基因如MYB、WRKY、ERF、NAC、硝酸鹽和鋅轉運蛋白，以及參與脫落酸、水楊酸和乙烯信號通路的基因在轉基因植株中的表達量高于非轉基因植株，研究結果為揭示轉基因番木瓜抗PRSV 的機制提供了基礎[31]。研究發現，殼聚糖N（CTS-N）誘導后，與抗病相關的WAKY基因及CML、CAML鈣調蛋白相關基因表達量上調，IAA 生長素基因誘導下調表達，抗氧化酶等活性提高，增強了植株的抗性，可有效防控番木瓜環斑花葉病及番木瓜畸形花葉病[32-33]。鄢興祥[34]研究發現，香菇多糖10 g/L+寧南霉素0.05 g/L復配劑處理PRSV 侵染的番木瓜，病程相關蛋白（PR1）、乙烯響應轉錄因子（ERF1）都上調表達，相關防御酶基因上調，次生代謝物得到激活，苯丙烷類、角質、蠟等物質合成，從而提高了植株的抗病能力。

一種由病毒侵染引起的只發生在開花后的番木瓜遲發性黏病（PSD），研究發現SA 信號參與了遲發性黏病的發生，開花前，與逆境和運輸相關的基因上調，與代謝相關的基因下調，其中一些水楊酸（SA）激活的基因得到了誘導，如PR1、PR2、PR5、WRKY轉錄因子、ROS和胼胝質基因，可抑制PSD 的發生，但是開花后，SA 信號的負調控因子：NPR1-抑制劑（NPR1-I/NIM1-I）候選基因、編碼UDP-葡糖基轉移酶（UGTs）的基因以及幾個與乙烯途徑有關的基因的轉錄本的誘導卻阻礙了植株的耐受性，從而引起PSD 的發生[35]。

由歐文氏菌引起的番木瓜枯萎病致病機制也有報道[36]。3 條關鍵通路次生代謝產物的生物合成、微生物在不同環境中的代謝以及ABC 轉運蛋白參與了歐文氏菌的致病過程。歐文氏菌侵染早期的生物過程為對刺激的響應，跨膜轉運、裂解酶活性和結構分子活性。Ⅲ型分泌系統（T3SS）蛋白家族成員在歐文氏菌致病機制的啟動中具有重要作用。

對病害的轉錄組學研究可以更好地了解致病機制，從而為病害的防治以及選育抗病品種提供依據。

5 番木瓜成熟機制的轉錄組研究

番木瓜果實的成熟是一個類胡蘿卜素積累、肉色和風味改變、果實軟化的復雜過程，與氨基酸、碳水化合物、脂類以及核苷酸等的代謝相關[37]，CpACO4、CpPDS、CpXTH30和CpXTH31等4 個番木瓜果實成熟差異表達候選基因可能在番木瓜果實成熟過程中起重要作用[38]。MADS-box、NAC和AP2/ERF基因家族的轉錄因子（TFs）參與了番木瓜成熟的調控[39]，果實發育和成熟顯著誘導CpARF2表達[40]。其中XTH30、GLUB41、PL、PMIS、CPSP、CHLM、MYB類轉錄因子可能參與了果實成熟衰老進程[41-42]。

TF 家族成員通過參與光信號調控，進而參與調控類胡蘿卜素基因的表達，CpbHLH1和CpbHLH2單獨調控番茄紅素β-環化酶基因（CpCYC-B和CpLCY-B）的轉錄[43-44]。CpNAC2和CpEIN3a相互作用，激活類胡蘿卜素合成相關基因CpPDS2/4、CpZDS、CpLCY-e和CpCHY-b的表達，進而參與后熟過程中類胡蘿卜素合成[45]。馮力[42]發現3 個葉綠素和類胡蘿卜素代謝途徑基因CHY-B、CHLM、FER1。外源乙烯加速了番木瓜由綠色向黃色的著色，Chy-b可能在番木瓜果實的著色中起重要作用[46-47]。ABIL46-like和NCED3基因表達和果實轉色有關[48]。miR4993-x、miR815-y 和miR7810-x 等miRNA 和果實顏色調控相關[49]。

番木瓜果實軟化過程復雜，有明顯的細胞壁水解酶，如果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等參與該過程[46]，乙烯觸發是引起番木瓜果肉快速軟化的主要事件，乙烯處理后ACO、ACS和SAM-Mtase基因均上調[47]。其中PYL4-like、PYL9、ABIL2-like、GT、CpEXPA2、XTH30、GLU-B、PL、EGase、EXPA、PMIS等基因表達參與果實成熟軟化[42,48,50-51]。miR167-y、miR4993-x、miR3946-x 和miR5059-x等miRNA 和果實軟化調控相關[49]。

1-甲基環丙烯（1-MCP）可以有效抑制乙烯信號轉導，從而達到保鮮，延長果實貯藏期。但是過高的處理濃度會導致番木瓜果實“橡皮化”，喪失商品價值。郭子娟[52]和李文文[53]研究發現，高于0.3 μL/L 或者1.0 μL/L 的1-MCP 處理番木瓜果實35 d后，番木瓜果實出現“橡皮化”，可能與內切葡聚糖酶活性、內切木聚糖酶、β-半乳糖苷酶的活性較低、基因的轉錄水平也較低，細胞壁結構的完整性得到維持、細胞壁得不到降解，endo-1,4-Xyl、endo-1,3-Glu和β-Gal等基因的表達水平受到抑制有關。長期1-MCP 處理嚴重改變了果實成熟過程中的代謝產物，降低了三羧酸循環的各種能量代謝物，其中以乙二醇酸循環影響最為顯著，苯丙烷途徑也受到影響，加速了果實成熟過程中木質素積累，延緩了纖維素降解，可推斷細胞壁代謝和生長調節劑信號通路與番木瓜果實成熟障礙密切相關。Cai 等[54]繪制了果實成熟過程中miRNA 和靶基因的網絡調控圖，發現果實成熟過程中植物生長調節劑信號通路起重要作用，cpa-miR390a和cpa-miR396分別靶向CpARF19-like和CpERF RAP2-12-like，影響乙烯和生長素信號通路，進而影響番木瓜成熟[55-56]。

6 展望

轉錄組學技術的應用，對深入了解番木瓜組培、性別分化、抗逆、抗病、成熟機制有至關重要的作用，掌握這些理論知識，有助于我們培育抗逆、抗病、高產、優質的番木瓜品種，采后更好地貯藏、保鮮，延長貨架期。通過分析當前轉錄組技術在番木瓜上的應用研究現狀，結合國內外植物領域轉錄組的研究熱點，提出3 點建議，以期為番木瓜轉錄組的研究和應用提供新的思路。

一是加強番木瓜轉錄組、蛋白組、代謝組等多組學技術結合的研究。目前多組學技術結合對植物的研究已經有了很多的應用。曾建斌[57]運用轉錄組、蛋白組和代謝組學技術揭示了野生大麥耐低鉀的分子機制，發現在低鉀環境下，耐低鉀大麥通過提高脯氨酸和抗壞血酸等活性氧自由基清除劑的含量來提高抗氧化脅迫能力，苯丙氨酸解氨酶（PAL）介導的苯丙烷類次生代謝途徑和乙烯響應代謝通路可用來解釋低鉀耐性基因型差異的分子機制。周會娜等[58]采用轉錄組學和蛋白組學技術研究了選自3 個不同香煙區的中部煙葉葉片，了解煙草代謝網絡，影響煙葉香型的代謝產物以及與目標代謝物相關的基因。在番木瓜研究上，應用多組學技術進行研究的報道相對較少。Zheng 等[55]通過代謝組學和轉錄組學的結合分析1-MCP 處理不當導致的成熟障礙機制，發現1-MCP 長期處理后，三羧酸循環的各種能量代謝產物減少，尤其是乙醇酸循環和苯基丙烷途徑受影響最大。Agopian 等[59]運用蛋白組學和代謝組學技術分析了乙烯對番木瓜采后品質的影響，發現極性代謝物在刺激成熟過程中表現出不同的模式，膜破裂和氧化過程的變化可能是揮發性化合物產生的原因，改變了番木瓜的一些感官品質，可將γ-氨基丁酸水平作為番木瓜發育和成熟階段一個強有力的生物學標記。多組學技術的應用，能夠進行更準確、更快速的基因功能研究和挖掘，加快高產優質番木瓜品種的選育進程，促進番木瓜產業的發展。

二是加強對番木瓜蛋白酶表達起關鍵調控作用的基因的挖掘。番木瓜不但營養豐富，番木瓜蛋白酶在食品工業和醫學領域應用廣泛，目前我國的番木瓜蛋白酶需求量極大，選育高漿番木瓜品種，提高番木瓜漿產量，具有廣闊的應用前景。分析番木瓜蛋白酶形成的分子機制，可為選育高漿品種提供參考和理論依據。

三是探索第三代測序技術在番木瓜上的應用。第三代測序技術有讀長更長、不需要拼接、能有效避免拼接錯誤等特點[60]，已成功應用于人類造血組細胞中的巨核細胞，及一些蘑菇狀真菌種類的轉錄組測序[61-62]，尚未見相關技術在番木瓜上的應用。因此，在今后的研究中，應結合更先進的技術和手段，定位高漿、抗病等功能基因并進行新品種的選育，加快育種進程，更好地促進番木瓜產業的發展。