沙利度胺灌胃對煙霧暴露致大鼠肺間質纖維化合并肺氣腫的影響及其機制

魏會強，郭麗萍，侯彥琨，郝秀玲，馬志敏，柴永娜

1河北醫科大學第二醫院呼吸內科，石家莊 050060；

2河北醫科大學第二醫院中西醫結合心血管內科

肺間質纖維化合并肺氣腫（CPFE）是一種吸煙相關的間質性肺疾病，屬于肺纖維化的一種特殊表型，CT影像表現為雙上葉肺氣腫和雙下葉肺纖維化［1］。一般認為，肺氣腫和肺纖維化在臨床上是兩種不相關的疾病，但隨著胸部高分辨CT的應用，發現許多吸煙患者同時伴有肺間質纖維化和肺氣腫的影像改變，因此煙霧暴露是導致CPFE的主要危險因素［2］。目前，臨床通常使用激素及免疫抑制劑治療CPFE。氫化可的松是從腎上腺皮質中提取出的對糖類代謝具有較強作用的糖皮質激素，是臨床治療CPFE的常用藥物，療效確切。但長期應用糖皮質激素可能引發較嚴重的不良反應，如肺部或機體其他部位發生細菌或真菌感染等。沙利度胺是一種谷氨酸衍生物，具有免疫抑制及抗血管生成等作用，近年來常被用于抗腫瘤治療，而關于其在CPFE中的治療作用鮮有報道。2020年7月—2021年12月，本研究通過煙霧暴露誘導小鼠CPFE，觀察沙利度胺在此過程中對CPFE的改善作用并分析其機制，希望可以為臨床治療CPFE提供新的治療方向及相應的理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料雄性SD大鼠120只，體質量（210±10）g，購自河北醫科大學實驗動物中心。沙利度胺溶液購自常州制藥有限公司，轉化生長因子β1（TGF-β1）、血管內皮生長因子（VEGF）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA檢測試劑盒購自上海巧伊生物技術有限公司。

1.2 動物分組與處理將SD大鼠隨機分為對照組、煙霧暴露組、沙利度胺組、陽性藥物對照組各30只。煙霧暴露組、沙利度胺組、陽性藥物對照組分別置于自制的40 cm×50 cm×60 cm的有機玻璃容器內，容器內放入香煙進行煙霧暴露（5支/次，2次/天），每次暴露在煙霧中的時間為1 h，共暴露30 d。沙利度胺組于煙霧暴露第1天用1%沙利度胺溶液（100 mg/kg）灌胃，每天1次；陽性對照組于煙霧暴露第1天腹腔內注射氫化可的松（80 mg/kg），每天1次。對照組置于相同容器內，呼吸新鮮空氣。各組大鼠均給予普通飼料喂養，自由飲水。

1.3 肺組織病理觀察采用HE染色及Masson染色。于煙霧暴露第7、15、30天，分別取10只各組大鼠（沙利度胺組大鼠分別于煙霧暴露第5天及第17天各死亡2只）腹腔內灌注麻醉藥物戊巴比妥鈉（50 mg/kg），通過股動脈放血的方式處死，放血初收集血液待檢，處死后快速開胸，取出右肺上葉及下葉，用4%多聚甲醛溶液固定，制成石蠟切片。HE染色：將制作好的石蠟切片脫蠟、透明、脫水，蘇木素染色，鹽酸乙醇分化，伊紅染色，脫水、脫蠟液透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察。Masson染色：將制作好的石蠟切片脫蠟、透明、脫水，蘇木素染色，酸性乙醇分化液分化，Masson藍化液返藍，品紅染液染色，苯胺藍液或綠液復染，脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

1.4 血清TGF-β1、VEGF和TNF-α水平檢測采用ELISA法。將從股動脈收集的各組大鼠血液標本在室溫凝固30 min后，3 000 r/min離心15 min，取上清液分裝于試管內，于-80℃冰箱內保存。取各組-80℃冰箱保存的血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測血清TGF-β1、VEGF和TNF-α水平。

1.5 統計學方法采用SPSS17.0統計軟件。計量資料通過Sample K-S進行正態檢驗，符合正態分布的以±s表示，組間比較行t檢驗，多組間比較行方差分析，不同時點測量數據比較行重復測量的方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肺組織病理學變化比較

2.1.1 HE染色對照組大鼠肺泡腔結構正常，肺泡腔內無明顯炎癥及纖維化的呈現。煙霧暴露組大鼠在第7天時病變部位肺泡擴張，肺泡間隔變窄，以上肺為甚，中下肺部分肺泡萎縮，肺泡間隔變厚，毛細血管再生明顯，呈簇狀聚集，肺泡間隔顯著增寬，肺泡內可見紅細胞及炎癥細胞，其中炎癥細胞以巨噬細胞和淋巴細胞為甚，同時伴大量成纖維細胞滲出；第15天時可見炎癥細胞減少，肺泡炎癥緩解，上葉部分肺泡持續擴張有融合趨勢，擴張肺泡可溶解成囊腫，下葉肺泡壁較前明顯增厚，成纖維細胞分化明顯，成纖維細胞大量增多，部分肺泡結構逐漸消失，形成了更多的新毛細血管；第30天時可見肺大瘡與肺間質纖維化交替存在，不過仍以上肺肺大瘡、下肺纖維化為甚，有局部淋巴細胞滲出，但炎癥反應匱乏，血管缺如。沙利度胺組及陽性藥物對照組在各時點肺組織病理改變與煙霧暴露組大體相同，但肺泡炎癥、纖維化及肺大瘡程度明顯減輕。見OSID碼圖1～3。

2.1.2 Masson染色對照組大鼠右下肺組織中細胞外基質出現少許膠原纖維被染成藍色。煙霧暴露組在第7天時出現肺泡上皮損傷和上皮下基底膜破壞，成纖維細胞聚集，膠原蛋白沉積致纖維化，中、下肺部出現膠原纖維，可見少量染成藍色的膠原纖維；第15天時肺泡壁厚度增加，成纖維細胞聚集，部分肺泡結構逐漸消失，形成纖維化及大量瘢痕組織，可見大量染藍的膠原纖維；30天時上肺大瘡較前變化不大，下肺可見大量肺泡壁破壞融合，呈蜂窩改變，可見大量密集的藍色膠原纖維。與煙霧暴露組比較，沙利度胺組和陽性藥物對照組膠原含量均減少，肺大瘡嚴重程度減低。見OSID碼圖4～6。

2.2 各組大鼠不同時點血清TGF-β1、VEGF、TNF-α水平比較各組大鼠同時點血清TGF-β1、VEGF、TNF-α水平比較，煙霧暴露組＞陽性藥物對照組、沙利度胺組＞對照組（P均＜0.05），沙利度胺組與陽性藥物對照組同時點TGF-β1、VEGF、TNF-α水平差異無統計學意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠不同時點血清TGF-β1、VEGF、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

表1 各組大鼠不同時點血清TGF-β1、VEGF、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

注：與對照組同時點比較，△P＜0.05；與模型組同時點比較，*P＜0.05。

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3 討論

目前，CPFE的發病機制仍不明確，臨床觀察到CPFE常發于男性，且多數有吸煙史。大量臨床研究顯示，吸煙與肺氣腫及肺間質纖維化的發病相關，是肺氣腫及肺間質纖維化的共同危險因素。臨床上可見，有吸煙史的患者可同時出現肺氣腫和肺間質纖維化的病理變化，其上肺主要表現為小葉中心性肺氣腫，下肺以尋常型間質性肺炎為主要類型。煙霧吸入可趨化炎癥細菌入侵肺內，并產生一定的炎癥反應，損害肺泡組織，這在一方面可引起肺氣腫，另一方面又可能引發肺部間質纖維化早期的炎癥反應而產生纖維化［2］。本研究通過將大鼠暴露于煙霧之中誘導小鼠CPFE，經肺組織HE染色及Masson染色可見煙霧暴露組大鼠存在肺大瘡及肺纖維化，提示CPFE誘導成功。目前，激素及免疫抑制劑是臨床常用的CPFE的治療藥物。在肺氣腫及肺纖維化形成的過程中，會產生大量炎癥因子及介質，激素及免疫抑制劑在理論上均能抑制炎癥進一步加重，從而阻斷病情惡化。本研究在誘導大鼠CPFE的過程中，分別用氫化可的松及沙利度胺干預，通過觀察肺組織病理學變化可見，與煙霧暴露組比較，陽性藥物對照組及沙利度胺組肺部炎癥及肺大泡、肺纖維化程度明顯減輕；但陽性藥物對照組與沙利度胺組比較病理緩解程度無明顯差異，提示氫化可的松及沙利度胺均可改善煙霧暴露誘導的小鼠CPFE。

肺泡巨噬細胞、單核細胞、肺成纖維細胞等多種細胞均能產生許多炎癥因子，這些炎癥因子在CPFE發生中起重要作用。研究顯示，TNF-α與肺間質纖維化有著密切的關系，參與了纖維化的病理過程［3］。纖溶酶原激活物抑制物1（PAI-1）是一種單鏈糖蛋白，DING等［4］研究發現，PAI-1能夠與TNF-α、TGFβ1等相互作用，促進肺纖維化進程。由上可見，TNF-α、TGF-β1在肺間質纖維化形成中有著關鍵作用。有研究發現，吸煙肺氣腫患者早期血漿VEGF水平較不抽煙的正常人升高，而晚期則較不抽煙的正常人下降，提示VEGF與肺氣腫嚴重程度及煙霧暴露相關［5］。另外，VEGF對肺基質玻璃纖維化的發生發展亦有影響。研究顯示，新生血管再生及聚集在肺纖維化形成中起著關鍵作用，而VEGF信號途徑在新生血管形成中起著重要的調控作用，因此也參與了纖維化的形成［6-7］。因此，TGF-β1、VEGF、TNF-α均與肺氣腫及肺間質纖維化有著密切的關系。本研究結果顯示，與對照組比較，煙霧暴露組血清TGF-β1、VEGF、TNF-α水平均顯著升高，提示煙霧作為肺氣腫、肺間質纖維化形成的危險因素，可能通過影響以上三種因子的變化來誘導CPFE。

血管內皮細胞因子具有增加血管通透性、促進血管內皮細胞增殖等作用，與多種疾病的發生發展密切相關［8］。有學者發現，應用血管內皮細胞因子受體拮抗劑可誘導肺泡隔毛細血管內皮細胞凋亡，進而形成肺氣腫［9］。目前，CPFE尚無明確的治療手段，臨床中一般認為免疫抑制劑及激素療效相對肯定［10-11］。在20世紀50年代，沙利度胺作為一種鎮靜藥物進入市場，但后來因其嚴重的致畸形作用幾乎被全球禁用。然而，沙利度胺的作用并未被全盤否定，隨著對沙利度胺臨床應用的深入研究，發現沙利度胺有很多積極的臨床作用，特別是在免疫、抗炎、抗血管生成中取得了令人鼓舞的結果。ZHAO等［12］及YE等［13］通過對動物模型及臨床纖維化患者的相關研究發現，沙利度胺對肺間質纖維化有抑制作用。此外，多項研究表明，沙利度胺可通過下調TNF-α及TGF-β等炎癥細胞因子水平來減輕肺纖維化程度，進而抑制纖維化［14-15］。糖皮質激素治療肺間質纖維化及肺氣腫的療效已在臨床中相對肯定，尤其是對肺氣腫療效更加可靠，但治療機制仍不是完全明確［16］。有些專家認為，抑制炎癥反應為主要途徑，本研究使用氫化可的松及沙利度胺干預煙霧暴露誘導的CPFE并觀察血清中TGF-β1、VEGF、TNF-α水平，發現陽性藥物對照組及沙利度胺組血清TGF-β1、VEGF、TNF-α水平與煙霧暴露組比較下降明顯，提示沙利度胺及氫化可的松可能通過抑制TGF-β1、VEGF、TNF-α的表達改善CPFE的肺組織病理，緩解CPFE進展。

綜上所述，沙利度胺灌胃可減輕煙霧暴露所致大鼠CPFE，其機制可能與抑制TGF-β1、VEGF、TNF-α水平，減輕炎癥反應及抑制新生血管生成有關。本研究結果表明，沙利度胺及氫化可的松均可改善CPFE病理的惡化，但未對兩者聯合應用的效果進行觀察。有研究顯示，單獨應用糖皮質激素治療肺間質纖維化及肺氣腫效果不佳［17］。另有研究表明，激素聯合其他藥物治療能明顯緩解CPFE患者臨床癥狀，包括肺功能情況、血氣狀況等，提示聯合治療在臨床癥狀改善上可能具有更好的效果［10，18］。沙利度胺因嚴重不良反應一度被放棄使用于臨床，且其不良反應與劑量呈正相關。因此在臨床應用沙利度胺治療疾病時，一般都是聯合其他藥物應用，以減少沙利度胺的使用劑量，盡量避免其不良反應［19］。因此，我們擬在后續的研究中探討沙利度胺聯合氫化可的松對CPFE的改善作用是否優于單藥，以降低藥物單獨使用的不良反應，改善CPFE患者的預后，為臨床治療CPFE提供新的思路。