宮頸癌陰道灌洗液源外泌體差異表達miRNA篩選及其關鍵靶基因的生物信息學分析

呂單單，徐夢偉，王磊，木葉斯爾·買買提，林晨

1新疆醫科大學基礎醫學院，烏魯木齊8 300172；2新疆醫科大學公共衛生學院

宮頸癌是發生在子宮陰道部及宮頸管的、女性生殖系統最常見的惡性腫瘤。隨著醫療技術的發展，接受標準化治療的宮頸癌患者5年生存率約為80%，但是一旦發生轉移，其5年生存率將降至50%［1］。因此，宮頸癌的早期診斷和早期治療尤為重要。陰道分泌物由宮頸腺體分泌物等成分組成，可以反應宮頸分泌物的改變，與血液比較，其臨床上收集無創且方便，受其他系統影響較小，因此從陰道分泌物中尋找診斷、治療、預后等分子標志物是目前的研究熱點之一。外泌體是由多種細胞分泌的納米級囊泡外小體，其可攜帶多種miRNA從供體細胞轉移至受體細胞，在受體細胞中干擾基因表達，參與多種生物過程。2019年11月—12月，本研究通過超速離心法提取患者陰道灌洗液中的外泌體，分析宮頸癌患者陰道灌洗液源外泌體中差異表達的miRNA，并對差異表達miRNA序列對應基因組DNA序列進行靶位點預測，篩選出在宮頸癌中具有高度連通性的關鍵靶基因，以期為尋找宮頸癌的潛在生物標志物奠定實驗基礎。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料經新疆醫科大學倫理委員會批準（審批號：XJYKDXR202208240102），選取于我院行手術治療的宮頸癌患者及同期接受體檢的宮頸炎志愿者。納入標準：①宮頸癌患者：經組織病理學檢查確診為宮頸鱗狀細胞癌且未接受手術、放療或化療等治療；②宮頸炎患者：經組織病理學檢查確診為宮頸炎；③近期沒有服用常規處方藥或避孕藥，沒有獻血及懷孕；④3個月內沒有接種過疫苗；⑤患者及家屬簽署知情同意書。排除標準：①合并慢性、感染性、自身免疫性疾病；②合并遺傳性疾病；③合并其他類型腫瘤。共選取符合標準的宮頸癌患者及宮頸炎患者各5例。

1.2 樣本采集及外泌體提取采集宮頸癌患者及宮頸炎患者陰道灌洗液，采集完成后立即放入液氮中轉移至-80℃冰箱保存。采用超速離心法提取外泌體。37℃水浴解凍樣本，冰上放置；4℃2 000 r/min離心10 min，留取上清；4℃10 000 r/min離心30 min，取上清；樣本轉移至超高速離心管中，4℃110 000 r/min離心75 min，棄上清；用1 mL 1×PBS重懸沉淀，重懸后各用1×PBS稀釋，0.22 μm膜過濾；樣本轉移至超高速離心管，4℃110 000 r/min離心75 min，棄上清；沉淀用相應的1×PBS重懸，分裝，-80℃保存。

1.3 外泌體鑒定①形態觀察：采用透射電鏡（TEM）觀察外泌體形態。取外泌體凍存樣本，37℃水浴解凍。取10 μL滴于封口膜表面，夾取一片聚醋酸甲基乙烯—碳（Formvar-carbon）載樣銅網，將銅網Formvar膜面朝下放在懸液上輕蘸取適量外泌體懸液。在干燥環境中讓Formvar膜充分吸收5 min，使外泌體附著于Formvar膜表面。用0.75%二水合醋酸鈾酰染色5 min，并在PBS中漂洗3次，輕輕夾取銅網，將多余水分用吸水紙上吸干，于電鏡下觀察攝片。②粒徑大小：采用納米顆粒追蹤分析（NTA）鑒定外泌體粒徑大小。外泌體樣本水浴解凍后用PBS緩沖液稀釋至顆粒濃度108～109/mL，用移液槍向檢測槽注入1 mL稀釋的外泌體溶液，使用Nano ZS90粒徑儀進行檢測并記錄分析數據。

1.4 宮頸癌外泌體差異表達miRNA篩選取宮頸癌患者及宮頸炎患者陰道灌洗液提取的外泌體樣本制作基因芯片（上海華盈生物醫藥科技有限公司）。對制作完成的基因芯片本身及芯片數據做質量控制，芯片掃描圖上無物理劃傷，芯片掃描圖放大后能清晰顯示。芯片陣列名以及角落的黑白棋盤狀圖案，表示B2 Oligo強陽性雜交質控合格（OSID碼圖1）。采用R語言進行宮頸癌外泌體差異表達miRNA分析，通過T-test計算得到P值。miRNA序列差異顯著性標準按差異倍數＞2、組內樣本數≥3時，P＜0.05進行篩選；進一步選出差異倍數前20的miRNA進行后續分析。

1.5 差異表達miRNA靶基因GO生物功能與KEGG通路富集分析通過mirtarBase數據庫對宮頸癌外泌體差異表達miRNA進行靶基因預測。通過R語言的clusterProfiler包對靶基因進行GO生物功能、KEGG通路富集分析。以P＜0.05為差異有統計學意義，選擇分析項目為生物過程、分子功能、細胞成分及信號通路。根據P值大小進行排序，篩選排名前40的生物過程及信號通路。

1.6 宮頸癌差異表達miRNA關鍵靶基因篩選運用STRING10.5（https：//string-db.org/）在線工具選擇Multiple Proteins，物種選擇Home sapiens，對差異表達miRNA靶基因進行蛋白質—蛋白質互相作用（PPI）網絡分析。運用Cytoscap3.8.0中的cytohubba插件對PPI網絡進行拓撲分析，篩選出排名前20的具有高度連通性的樞紐靶基因。采用R語言對樞紐靶基因進行KEGG信號通路富集分析，與差異表達miRNA靶基因富集的KEGG信號通路取交集，篩選出共有的關鍵信號通路及與之相聯系的關鍵靶基因。

2 結果

2.1 外泌體鑒定結果TEM可觀察到清晰的囊泡結構，呈雙層囊膜、茶托型或一側凹陷的半球形，為典型的外泌體形態。NTA顯示，樣本粒徑大小均符合外泌體的粒徑標準（30～190 nm）。見OSID碼圖2、3。

2.2 宮頸癌外泌體差異表達miRNA篩選結果宮頸癌陰道灌洗液源外泌體中顯著差異表達的miRNA共有84個，其中上調71個、下調13個。差異倍數前20的miRNA中上調18個、下調2個。見表1。

表1 宮頸癌外泌體差異表達miRNA篩選結果

2.3 差異表達miRNA靶基因GO生物功能與KEGG通路富集分析結果通過mirtarBase數據庫獲得與差異表達miRNA相關的273個靶基因。GO生物功能分析顯示，差異表達miRNA靶基因主要分布于細胞黏附斑、細胞—基質黏附結點、細胞—基質結點等，主要富集的生物過程為角蛋白結合、泛素樣蛋白連接酶結合、泛素類蛋白連接酶結合等，主要富集的分子功能為核糖核蛋白復合物的生物生成、病毒基因表達、病毒轉錄等。KEGG信號通路分析顯示，差異表達miRNA靶基因主要富集的信號通路為癌癥中的蛋白聚糖、細胞衰老、神經營養素信號通路等。見OSID碼圖4、5。

2.4 宮頸癌差異表達miRNA關鍵靶基因篩選結果宮頸癌中具有高度連通性的樞紐靶基因分別為FGF2、PDGFRB、PIK3R1、NRAS、IGF1R、MAPK14、AGO1、ITGB3、BCL2L1、H2AFX、AGO4、TNRC6B、SOCS1、FRS2、TGFBR1、EDN1、THBS1、CDKN1B、BCL2L11、ZNF217。見OSID碼 圖6、7。宮頸癌關鍵信號通路為AMPK信號通路、mTOR信號通路、細胞凋亡、癌癥中的蛋白聚糖、TNF信號通路、FoxO信號通路、PD-L1在腫瘤中的表達及PD-1檢測點通路，關鍵基因為PIK3R1、EDN1、PDGFB、FGF2、IGF1R、THB1S、ITGB3、TGFBR1、NRAS、MAPK14。見表2。

表2 宮頸癌差異表達miRNA調控的關鍵信號通路及參與基因分析結果

3 討論

宮頸癌發病率有明顯的地區差異，新疆是宮頸癌高發地區，維吾爾族婦女宮頸癌的發病率居全國第一［2］。宮頸癌早期癥狀隱匿，許多患者發現癥狀就診時已為癌癥中晚期。因此，尋找新的宮頸癌生物標志物以對宮頸癌和癌前病變進行早期發現和治療，對降低宮頸癌發病率及病死率十分重要。

作為液體活檢領域“三大標桿”之一的外泌體，被認為是細胞間通訊、疾病診斷和預后循環生物標志物的重要載體。外泌體來源于細胞核內，由多囊泡體內陷腔化形成并通過多囊泡體與細胞膜融合而釋放到細胞外環境中，廣泛存在于血清、血漿、唾液、尿液、腦脊液和乳液等多種體液中，主要通過與靶細胞的細胞膜融合以及胞吞作用等方式將其內的miRNA、mRNA、lncRNA及蛋白質等物質傳遞到靶細胞內，參與免疫應答、細胞遷移、腫瘤侵襲、抗原提呈等過程［3］。多項研究表明，細胞中的miRNA可以包裝在外泌體中并釋放，外泌體miRNA并非被動釋放，而是在特定刺激下的選擇性分泌［4-5］。WU等［6］研究發現，血漿源外泌體miR-30d-5p和let-7d-3p是宮頸癌及其前體無創篩查的有價值的診斷生物標志物。LIU等［7］發現，宮頸癌患者陰道灌洗液源外泌體中的miR-21和miR-146a上調。本研究發現，宮頸癌患者陰道灌洗液源外泌體中顯著差異表達的miRNA共有84個，其中上調71個、下調13個，包括miR-320d、miR-320c、miR-24-3p、miR-191-5p、let-7d-5p、let-7a-5p、miR-23b-3p等。CAMPOS-VIGURI等［8］研究顯示，miR-23b-3p是宮頸癌中的腫瘤抑制因子，并通過直接調節絡氨酸激酶c-Met參與人宮頸癌細胞C33A及CaSki的增殖、遷移和侵襲的調節。另有研究發現，miR-320c能夠通過靶向GABRP來抑制宮頸癌中的遷移潛能［9］。

我們進一步對宮頸癌中差異表達miRNA的靶基因進行GO生物過程及KEGG信號通路富集分析，發現這些靶基因涉及細胞生長、凋亡、黏附及連接以及炎癥反應、巨噬細胞活化、蛋白質分解代謝等生物過程，并且能夠通過癌癥中的蛋白聚糖、細胞衰老、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路及NF-κB信號通路等影響宮頸癌的發生發展過程。這提示宮頸癌源外泌體能夠通過參與炎癥及免疫的調節，從而調控宮頸癌的發生發展。多項研究顯示，外泌體在腫瘤性炎癥微環境中起著關鍵作用［10-11］。使用STRING對差異表達miRNA靶基因進行PPI網絡分析，篩選出宮頸癌中具與有高度連通性的關鍵靶基因，分別為FGF2、PDGFRB、PIK3R1、NRAS、IGF1R、MAPK14、AGO1、ITGB3、BCL2L1、H2AFX、AGO4、TNRC6B、SOCS1、FRS2、TGFBR1、EDN1、THBS1、CDKN1B、BCL2L11、ZNF217。有研究表明，半夏提取物能夠通過抑制SOCS1和激活下游JAK2-STAT1/STAT4/STAT5通路，恢復人宮頸腫瘤浸潤性樹突狀細胞受損的功能［12］。WANG等［13］研究表明，miR-92a在宮頸癌組織中表達上調，通過負調控PIK3R1促進宮頸癌惡性發展。

綜上所述，我們采集宮頸癌及宮頸炎患者的陰道灌洗液，通過超速離心法提取其中外泌體，發現宮頸癌中miR-320d、miR-320c、miR-24-3p、miR-191-5p、let-7d-5p等miRNA存在顯著差異表達，且PIK3R1、EDN1、PDGFB、FGF2、IGF1R、THB1S、ITGB3、TGFBR1、NRAS、MAPK14等靶基因在宮頸癌中具有關鍵作用，提示陰道分泌物外泌體miRNA作為宮頸癌無創性生物標志物的可能性。由于外泌體含有眾多可以用來診斷疾病的分子載體，而且不需要常規活檢，故其在液體活檢方面有很大的前景。本研究采用超速離心法提取的外泌體中包含有非外泌體的囊泡，后續實驗可結合分子尺寸排阻色譜法或免疫親和捕獲技術中的酶聯免疫吸附測定進一步改進。盡管關于外泌體的收集、分離和鑒定存在一定的難度，且大多研究還停留在對細胞表型的探索上，但隨著納米顆粒追蹤分析、免疫蛋白捕獲和高通量測序等技術的快速發展，外泌體分離和鑒定的效率也將不斷提高，其作為疾病的無創性新生物標志物也隨之變為可能。未來可以通過大樣本實時熒光定量PCR驗證進一步證實外泌體中miRNA的差異表達情況，并構建差異miRNA抑制和過表達的載體，尋找其細胞表型變化及相關信號通路，為進一步探尋宮頸癌的分子標志物提供新思路。