miR-145過表達對缺氧誘導心肌細胞焦亡的抑制作用及其機制

浦湧，崔勝宇，吳浩亮，陶波，孟祥平，夏豪，徐林

1武漢經濟技術開發區（漢南區）人民醫院武漢大學人民醫院漢南醫院心內科，武漢 430090；

2武漢大學人民醫院武漢大學心血管病研究所心血管病湖北省重點實驗室心內科；

3武漢市第四醫院老年醫學科

微小RNA（miRNA）是一種小的非編碼RNA，可與相關靶基因的3'-非翻譯區結合，對靶基因產生負調控作用［1］。miRNA廣泛參與細胞增殖［2］、凋亡［3］、分化［4］等生理或病理過程，在細胞內具有重要的調控作用。作為miRNA的一種，miR-145已被證明對心血管疾病具有至關重要的影響。焦亡是細胞程序性死亡的一種類型，其在各種心血管疾病的發病中起著關鍵作用，可發生于心肌梗死［5］、心肌缺血再灌注損傷［6］、動脈粥樣硬化［7］、心力衰竭［8］等疾病中。焦亡同凋亡類似，是一個高度調控的細胞死亡過程，通過多種方式干預抑制這一過程在許多條件下具有心臟保護作用。炎癥小體的激活、Caspase-1的活性轉化、活性氧（ROS）表達增加以及OD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）、（IL-1β）、（IL-18）等炎癥因子的高表達是細胞焦亡發生的關鍵特征［9］。研究發現，miR-145能夠靶向負調控鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ），進而調控其下游分子核轉錄因子κB（NF-κB）［10］，且NF-κB信號的激活可進一步調控NLRP3的激活［11］。由于miR-145對心血管疾病具有的潛在保護作用，并且焦亡也發生于心肌細胞的損傷過程中，因此有必要研究miR-145是否可能通過對心肌細胞焦亡的調控發揮對心肌細胞的保護作用，同時是否通過CaMKⅡ/NF-κB信號通路影響心肌細胞焦亡。2022年1月—6月，本研究通過缺氧誘導心肌細胞損傷，觀察miR-145過表達對心肌細胞焦亡的影響并分析其機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料大鼠心肌細胞系H9C2購自中國科學院上海細胞庫，胎牛血清購自美國BIOEXPLORER Life Science公司，高糖培養基購自美國Cytiva公司，0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司，過表達miR-145腺病毒及其陰性對照病毒購自上海吉凱公司。超氧陰離子檢測試劑（活性氧檢測試劑）購自碧云天生物公司，逆轉錄-PCR試劑盒購自賽維爾生物科技公司，AnnexinV-PE/7-AAD凋亡染色試劑盒購自美國BD公司。磷酸化CaMKⅡ（p-CaMKⅡ）、磷酸化NF-κB（p-NF-κB）、GAPDH抗體均購自美國CST公司，NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18山羊抗兔及山羊抗小鼠抗體購自上海艾比瑪特生物醫藥公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及分組H9C2細胞置于含10%胎牛血清的高糖培養基中，于37℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。待細胞融合度達70%～80%時，分為正常組、缺氧組、缺氧+miR-145組、缺氧+陰性對照組。

1.2.2 細胞miR-145腺病毒感染及缺氧誘導缺氧+miR-145組、缺氧+陰性對照組分別使用腺病毒包裝的miR-145及腺病毒包裝的陰性對照序列與細胞共孵育6 h后換液，病毒感染復數（MOI）=50；正常組、缺氧組不做miR-145腺病毒感染處理。24 h后將缺氧組、缺氧+miR-145組、缺氧+陰性對照組細胞轉移至缺氧培養箱（1%氧氣濃度）中培養，正常組不做缺氧處理，24 h后收集細胞進行后續實驗。

1.2.3 細胞miR-145 mRNA表達檢測采用實時熒光定量PCR法。收集各組細胞，按照試劑盒說明常規提取總RNA，而后逆轉錄為cDNA，以此為模板，按照實時熒光定量PCR的說明書進行熒光定量PCR。循環條件：95℃10 min，95℃15 s、60℃30 s，共完成40個循環。引物序列：miR-145-5p上游為5′-ACACTCCAGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGA-3′，下 游 為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGGGATTC-3′；U6上游為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下 游 為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以U6為內參，按照用2－ΔΔCt計算各組miR-145的相對表達量。

1.2.4 細胞ROS水平檢測采用超氧化物陰離子探針（碧云天，S0063）。使用終濃度為2.5 μmol/L的超氧化物陰離子探針和細胞一起在37℃孵育30 min進行熒光探針裝載，PBS洗滌后，使用熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.5 細胞焦亡情況觀察采用TUNEL染色及流式細胞術。TUNEL染色：將各組細胞與TUNEL反應液在37℃黑暗條件下孵育90 min，用熒光顯微鏡記錄并拍照，計數TUNEL陽性細胞以反映心肌細胞焦亡情況。TUNEL陽性率=TUNEL陽性細胞數/總細胞數×100%。流式細胞術：取各組細胞，收集原培養液，PBS洗后加入胰酶消化1～3 min后終止消化，用移液槍吹打成單個細胞與上清液混勻，1 000 r/min離心5 min，去上清，PBS漂洗，1 000 r/min離 心5 min，去上清。加入100 μL 1X Annexin Binding Buffer重懸細胞，加入5 μL Annexin V-PE，加入5 μL 7-AAD，室溫避光15 min，上機前補加400 μL 1X Binding Buffer，上流式細胞儀檢測各組細胞死亡率。

1.2.6 細胞中焦亡相關因子表達檢測采用免疫組織化學及實時熒光定量PCR法。采用免疫組化法檢測NLRP3蛋白表達：細胞樣本在4%多聚甲醛固定后，使用內源性過氧化物酶阻斷劑孵育20 min，后漂洗3次，使用3%BSA封閉樣本3 min后，滴加配置好的NLRP3一抗液體孵育過夜。第2天將玻片孵育二抗后，使用DAB顯色，復染細胞核封片后在光鏡下拍照，觀察NLRP3蛋白表達情況。采用實時熒光定量PCR法檢測NLRP3、IL-1β、IL-18 mRNA表達：方法同“1.2.3”，循環條件：95℃30 s，95℃15 s、60℃10 s，共完成40個循環。引物序列：NLPR3上游 為5′-AGCTGCTCTTTGAGCCTGAG-3′，下 游 為5′-TCTGCTAGGCTCTTTGGTGC-3′；IL-1β上 游 為5′-TCGTGCTGTCTGACCCATGT-3′，下 游 為5′-ACAAAGCTCATGGAGAATACCACTT-3′；IL-18上游為5′-ACGGAGCATAAATGACCAAGTTC-3′，下游為5′-TCTGGGATTCGTTGGCTGTT-3′；GAPDH上游為5′-CCAAGGTCATCCATGACAACTT-3′，下游為5′-AGGGGCCATCCACAGTCTT-3′。以GAPDH為 內參，按 照 用2－ΔΔCt計 算 各 組NLRP3、IL-1β、IL-18 mRNA的相對表達量。

1.2.7 細胞中CaMKⅡ/NF-κB信號通路相關蛋白表達檢測采用Western blotting法。取各組細胞在裂解緩沖液中裂解得到總蛋白，通過凝膠電泳分離轉移到PVDF膜上。在5%的脫脂牛奶中封閉60 min后，在4℃與p-CaMKⅡ、p-NF-κB、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18及GAPDH抗體孵育過夜。第二天使用緩沖液洗膜后，在室溫下與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗或抗小鼠二抗孵育1 h。利用增強型化學光檢測試劑對蛋白條帶進行可視化，利用Image J軟件分析條帶灰度值。以GAPDH作為內源性對照，以目的條帶與對照條帶灰度比值作為目的蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法采用SPSS23.0統計軟件。計量資料采用Shapiro-Wilk方法行正態性檢驗，符合正態分布且方差齊性的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞miR-145 mRNA表達比較正常組、缺氧組、缺氧+miR-145組、缺氧+陰性對照組細胞miR-145 mRNA相對表達量分別為（1.00±0.10）、（0.62±0.05）、（6.43±0.40）、（0.59±0.14），細胞miR-145 mRNA相對表達量缺氧+miR-145組＞正常組＞缺氧組、缺氧+陰性對照組（P均＜0.05）。

2.2 各組細胞ROS水平比較正常組、缺氧組、缺氧+miR-145組、缺氧+陰性對照組細胞ROS水平分 別 為（1.04±0.09）、（3.00±0.20）、（1.61±0.17）、（3.25±0.23），細胞ROS水平缺氧組、缺氧+陰性對照組＞缺氧+miR-145組＞正常組（P均＜0.05）。

2.3 各組細胞中焦亡情況比較TUNEL染色顯示，正常組、缺氧組、缺氧+miR-145組、缺氧+陰性對照組細胞TUNEL陽性率分別為（14.33±4.04）、（60.00±3.00）、（45.00±3.00）、（65.00±2.29）；流式細胞術檢測顯示，正常組、缺氧組、缺氧+miR-145組、缺氧+陰性對照組細胞死亡率分別為（4.30±0.26）、（14.33±0.44）、（9.20±0.51）、（14.46±0.35）；細胞TUNEL陽性率、死亡率缺氧組、缺氧+陰性對照組＞缺氧+miR-145組＞正常組（P均＜0.05）。

2.4 各組細胞中焦亡相關因子表達比較免疫組化染色顯示，正常組、缺氧組、缺氧+miR-145組、缺氧+陰性對照組細胞NLRP3蛋白表達分別為（1.00±0.20）、（5.43±0.21）、（2.70±0.26）、（5.73±0.21），細胞NLRP3蛋白表達缺氧組、缺氧+陰性對照組＞缺氧+miR-145組＞正常組（P均＜0.05）。實時熒光定量PCR顯示，NLRP3、IL-1β、IL-18 mRNA表達缺氧組、缺氧+陰性對照組＞缺氧+miR-145組＞正常組（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組NLRP3、IL-1β、IL-18 mRNA表達比較（±s）

表1 各組NLRP3、IL-1β、IL-18 mRNA表達比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，與缺氧組比較，#P＜0.05。

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2.5 各組中CaMKⅡ/NF-κB信號通路相關蛋白表達比較細胞p-CaMKⅡ、p-NF-κB、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達缺氧組、缺氧+陰性對照組＞缺氧+miR-145組＞正常組（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組CaMKⅡ/NF-κB信號通路相關蛋白表達比較（±s）

表2 各組CaMKⅡ/NF-κB信號通路相關蛋白表達比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，與缺氧組比較，#P＜0.05。

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3 討論

心肌梗死是一種嚴重的冠狀動脈相關疾病，主要由冠狀動脈粥樣硬化血栓形成或多種原因造成心肌氧供失衡、心肌細胞損傷導致。動脈粥樣硬化斑塊被破壞后，引起血小板聚集，導致冠狀動脈阻塞，心肌缺血缺氧壞死。研究表明，梗死的心肌及缺血缺氧的心肌均伴隨細胞焦亡，發生梗死的心肌細胞中NLRP3、IL-1β、IL-18等炎癥細胞因子水平普遍升高，而施加干預對NLRP3炎癥小體抑制后，可以減少心肌焦亡，從而有效改善缺血缺氧誘導的心肌損傷［12］。miR-145定位于染色體5q32-33，長度約為4.08 kb，已被證明在多種心血管疾病中有著積極影響，并且可在心肌梗死相關損傷中發揮重要的調控作用。我們的研究發現，在遭受缺氧的H9C2心肌細胞中，miR-145表達顯著下調，這與LIU等［13］研究結果一致。而通過miR-145腺病毒感染H9C2細胞，發現細胞中miR-145表達顯著上調，提示成功建立過表達miR-145的腺病毒感染細胞。

研究顯示，在缺血缺氧的心肌中，過度的炎癥、氧化應激水平會加重心肌細胞損傷［10］。我們在研究中檢測了各組細胞內的ROS水平，發現缺氧組及缺氧+陰性對照組細胞內ROS水平較正常組均明顯升高，而缺氧+miR-145組細胞內ROS水平較缺氧組及缺氧+陰性對照組明顯下降，提示miR-145過表達的缺氧心肌細胞內ROS水平降低，氧化應激水平得到明顯改善。

細胞焦亡是與炎癥密切相關的程序性死亡，我們在研究中進一步檢測了細胞焦亡相關情況，發現經過缺氧誘導的細胞TUNEL陽性率、流式細胞術檢測的細胞死亡率均高于正常組，而在過表達miR-145的細胞中，細胞TUNEL陽性率、死亡率較缺氧組及缺氧+陰性對照組均有明顯改善。此外，我們還對焦亡發生的特征性指標NLRP3蛋白進行了免疫組化染色，并且對焦亡相關效應分子NLRP3、IL-1β、IL-18 mRNA進行了實時熒光定量PCR檢測，發現在缺氧+miR-145組中，NLRP3、IL-1β、IL-18表達均低于缺氧組及缺氧+陰性對照組，提示在心肌細胞中過表達miR-145可減輕缺氧引起的細胞焦亡。

ROS可激活CaMKⅡ信號進而加重心肌細胞損傷，并且miR-145被發現可通過對CaMKⅡ的靶向負調控發揮調控其下游信號的作用［13-14］。CaMKⅡ是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員之一，廣泛參與細胞鈣信號轉導、細胞存活、細胞增殖以及細胞炎癥或氧化應激反應［15-16］。目前，關于CaMKⅡ對細胞焦亡過程影響的報道較少，但CaMKⅡ在細胞焦亡過程中的可能作用仍可從以往的相關研究中推測。SUETOMI等［17］發現，心肌細胞中缺失CaMKⅡ可降低壓力過載誘導的心功能障礙和心臟炎癥水平，這種保護作用可能與缺失CaMKⅡ抑制了NF-κB及NLRP3的激活有關。此外，一項關于CaMKⅡ介導膠質母細胞瘤細胞中焦亡的研究顯示，Caspase家族及GSDME主要參與了CaMKⅡ介導的焦亡［18］。NFκB信號可作為CaMKⅡ的下游分子發揮作用［19］，并且有研究報道，激活的NF-κB信號可進一步調控NLRP3的激活［11］。本研究采用Western blotting法檢測了CaMKⅡ/NF-κB信號通路相關蛋白表達，發現在過表達miR-145的心肌細胞中，由缺氧引起的過度激活的CaMKⅡ信號被抑制，具體表現為p-CaMKⅡ較缺氧+陰性對照組顯著下調。此外，我們通過觀察NF-κB及其下游的NLRP3介導的焦亡信號通路發現，在缺氧及缺氧+陰性對照組中，CaMKⅡ/NF-κB信號通路及其下游的焦亡指標NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18均被激活；而在缺氧+miR-145組中，這些指標均有了顯著改善。以上結果提示，miR-145可以緩解ROS的產生，并且可抑制CaMKⅡ的活性進而降低p-NF-κB水平，影響NF-κB核轉位，這一級聯效應使焦亡相關蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的表達受到抑制，最終減輕了心肌細胞焦亡。

綜上所述，本研究通過miR-145腺病毒感染心肌細胞系H9C2并對其進行缺氧誘導，發現miR-145可通過對CaMKⅡ/NF-κB信號通路的抑制來發揮對心肌細胞的抗焦亡作用，進而保護缺氧引起的心肌細胞損傷。盡管miR-145在心血管疾病中的保護作用已被廣泛證實，但其對焦亡的調控作用尚未見報道，本研究或可為心肌損傷今后可能的靶向治療以及miR-145的生物學功能提供新的見解。