咖啡因治療早產兒呼吸暫停相關基因多態性的研究進展

謝江彪 綜述 林新祝 審校

（廈門市婦幼保健院（廈門大學附屬婦女兒童醫院）新生兒科/廈門市圍產-新生兒感染重點實驗室，福建廈門 361001）

1 早產兒呼吸暫停

早產兒呼吸暫停（apnea of prematurity，AOP）是指胎齡＜37周的早產兒呼吸停止時間≥20 s，或不足20 s 但伴有心率下降（＜100 次/min）、出現青紫或蒼白［1］。AOP 的發生主要與呼吸控制系統的發育不成熟有關，發病率與胎齡和出生體重呈負相關。據報道，胎齡＜28 周和出生體重＜1 000 g 的早產兒幾乎都有AOP 的相關癥狀，胎齡為30 周、34周和＞34周的早產兒AOP發生率分別為85%、20%和10%；出生體重＜1 500 g 和＜2 500 g 的早產兒AOP發生率分別為53.7%和25%，一定程度上，早產兒胎齡和出生體重越低，呼吸中樞發育越不成熟，越容易發生呼吸暫停［1-4］。

研究發現，AOP 不僅與呼吸中樞發育程度相關，遺傳因素也參與了AOP 的發病。2003 年的一項研究顯示，父母為一級近親結婚的早產兒AOP患病率增高（OR=2.9，95%CI：1.3～6.4），首次表明了遺傳因素在AOP 發病中的重要作用［5］。一項單中心的回顧性研究納入了317 對胎齡＜37 周的雙胞胎，發現在同性別的雙胞胎中AOP 的遺傳效應占87%（95%CI：0.64～0.97）［6］。Kumral 等［7］研究發現，AOP 的發病與早產兒攜帶的腺苷受體基因有關。因此，AOP 這種與呼吸控制系統發育相關的疾病同時具有重要的遺傳基礎。

2 咖啡因治療AOP的個體差異

甲基黃嘌呤類藥物，如咖啡因、茶堿、氨茶堿是治療AOP 的主要藥物，咖啡因與其他甲基黃嘌呤類藥物相比，其半衰期長、治療窗廣、不良反應少、生物利用度高且通常不需要監測血藥濃度［8］，現已成為治療AOP 的首選藥物。一項咖啡因治療AOP 的大型隨機對照研究，已經證明了標準劑量枸櫞酸咖啡因（負荷劑量20 mg/kg，維持劑量為每日5 mg/kg）的安全性和有效性［9］，但實際臨床中發現，在相同的治療方案下，一些患兒對咖啡因療效不佳，使用咖啡因后仍然存在頻發的呼吸暫停［10-11］，需要更高劑量的咖啡因或必須聯合正壓通氣支持治療。Rosen 等［12］納入66 名胎齡＜33 周的早產兒，其中36 名對7.5 mg/kg 維持劑量的枸櫞酸咖啡因無反應，需進一步增至10 mg/kg。我國一項研究納入78 名極低出生體重兒，發現10 mg/kg 維持劑量枸櫞酸咖啡因與5 mg/kg 相比有效 率 更 高（71% vs 48%，P＜0.05）［13］。Mokhtar等［14］對43 名AOP 患兒的研究顯示，18 名對咖啡因反應良好，使用咖啡因后呼吸暫停次數顯著減少，25 名對咖啡因治療無反應，用藥后呼吸暫停頻率減少不足50%或必須聯合正壓通氣治療。這表明咖啡因治療AOP 的療效存在個體差異。咖啡因是世界上使用最多的精神活性物質，對中樞神經、呼吸、心血管等多個系統產生影響，有緩解疲勞、提高警覺、改善運動性能等功效［15］。在成人中，不同個體對咖啡因的敏感性不同，使用咖啡因后的效應存在個體差異，人們已經發現遺傳變異是引起這種差異的一個重要來源［16］。因此，遺傳變異可以解釋咖啡因治療AOP 患兒療效的個體差異。

3 咖啡因治療基因組學研究現狀

隨著分子生物學的發展，對于咖啡因治療的研究已經達到基因層面。單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）是由基因組DNA序列中單個堿基的轉換或顛換所形成的變異，是人類遺傳變異中最常見的一種，占所有已知多態性的90%以上。基因多態性尤其SNP 對咖啡因治療AOP療效的影響已成為近年來研究的熱點。

如前所述，AOP 的患病受到遺傳因素的影響，且觀察到在相同治療方案下咖啡因對一些AOP 患兒治療效果不佳，需要更高劑量或聯合呼吸支持，表明該藥在早產兒中存在療效的個體差異性。為了提高咖啡因使用的安全性和有效性，有必要對影響其療效的遺傳因素進行分析。目前關于咖啡因治療AOP 療效的研究基因達20 余種。主要針對以下3個方面的基因：（1）咖啡因作用受體相關基因，包括4種腺苷受體基因；（2）咖啡因代謝相關基因，包括6 種CYP基因、AHR基因；（3）與咖啡因作用相關的其他14 種基因，包括9 種PDE基因和ADA、CLOCK、BMAL1、AHRR、ARNT基因。 其 中ADORA1、ADORA2A、ADORA3、PDE4D、AHR、ADA、CLOCK基因與咖啡因療效密切相關，且研究也較為深入。

3.1 咖啡因作用受體相關基因多態性

3.1.1ADORA1基 因ADORA1基 因 為 腺 苷 受體A1基因，位于染色體1q32.1上，長約39 kb，包含4個外顯子。ADORA1基因編碼的A1受體由326個氨基酸組成，在大腦中廣泛表達，含量最高，主要分布于神經突觸［17］。咖啡因通過拮抗大腦內A1 受體，減少腺苷對呼吸的抑制作用，提高呼吸中樞對高碳酸血癥的敏感性，增加神經興奮性和呼吸驅動［18］。ADORA1基因在人群中表達為高度多態性，在不同地區和民族中各基因型分布頻率差異顯著，rs10920568、rs16851030、rs12744240、rs9660662、rs3766560、rs3753472 等是ADORA1基因常見且研究較多的SNP 位點。Kumral 等［7］的一項前瞻性病例對照研究首次證明了ADORA1基因多態性和咖啡因療效的相關性，在55 名AOP 患兒中，25名對咖啡因治療無反應，在胎齡＞28周的早產兒中，對咖啡因治療有反應的早產兒攜帶ADORA1rs16851030 位點CC 基 因 型，CT 和TT 基因型對咖啡因治療無反應（P=0.002）。He等［19］的研究入選了14個ADORA1的SNP 位點，發現咖啡因療效在rs10920568和rs12744240位點不同基因型中存在差異，攜帶rs10920568 位點G 突變基因和rs12744240 位點T 突變基因對咖啡因無反應（P＜0.05）。因此，咖啡因療效與ADORA1基因不同位點的SNP相關。

3.1.2ADORA2A基因ADORA2A基因為腺苷受體A2a 基因，定位于染色體22q11.23 上，長約18 kb，包含6個外顯子。ADORA2A基因編碼的A2a 受體由412個氨基酸組成，在大腦中主要分布于含有高濃度多巴胺的區域，在嗅覺結節和背側紋狀體神經元也有高水平表達［20］。咖啡因作用于A2a受體，阻斷γ‐氨基丁酸的釋放，減少對低氧的抑制，增加呼吸輸出［18］，同時能調節膈肌的神經活動而刺激膈肌收縮［21］。研究表明，咖啡因引起的焦慮反應和對睡眠、運動的影響受到ADORA2A基 因 多個 位 點SNP 的 影 響［22］。rs5751876 是ADORA2A中研究最多的常見SNP 位點，與其他SNP位點如rs2298383和rs3761422等處于高度連鎖不平衡狀態。此位點突變為同義突變，不影響氨基酸序列，但其突變可能改變A2a受體活性和數量表達［23］。Childs等［24］研究發現rs5751876位點的不同基因型對服用咖啡因后引起的焦慮反應有顯著影響（P＜0.05），相比于T等位基因攜帶者，C等位基因攜帶者攝入咖啡因后更容易產生焦慮，對咖啡因的敏感度更高。Mokhtar等［14］研究表明，對咖啡因無反應的早產兒rs5751876 位點T 等位基因頻率顯著升高（P=0.019，OR=2.89，95%CI：1.17～7.13）。 Kumral 等［7］研究發現 rs5751876、rs35320474、rs3761422位點CT和TT基因型AOP患病風險顯著增高。此外，He 等［19］的研究中發現rs34923252 位點A 突變基因攜帶者和rs5996696 位點C突變基因攜帶者對咖啡因反應優于未突變的純合子基因型個體。

3.1.3ADORA2B、ADORA3基因ADORA2B基因為腺苷受體A2b 基因，定位于染色體17p12上，長約30 kb，包含6個外顯子。ADORA2B基因編碼的A2b受體由328個氨基酸組成，在全身都有表達，但表達程度普遍較低，在4種腺苷受體中對腺苷的親和力最低［25］。ADORA3基因為腺苷受體A3基因，定位于染色體1p13.2上，長約80 kb，包含2個外顯子，其編碼的A3受體由318個氨基酸組成，在睪丸、大腦、腎臟和肺中高表達［26］。A2b和A3 受體的激活都與肺部炎癥介質釋放有關，拮抗A2b 和A3 受體可以減輕過敏原等誘導的肺部炎癥和支氣管痙攣，改善呼吸功能［27］。A2b 和A3 受體的抑制需要高濃度的咖啡因，而低濃度的咖啡因即可對A1 和A2a 受體產生拮抗作用，因此咖啡因治療AOP主要通過拮抗A1和A2a受體［28］。目前尚未發現ADORA2B基因的多態性與咖啡因療效的相關性，但在ADORA3基因中發現rs10776727 和rs2298191 位點的SNP 與咖啡因療效有關［19］，攜帶rs10776727 位點A 突變基因和rs2298191 位點C 突變基因對咖啡因治療無反應，其具體機制尚不明確，這些位點的SNP 對咖啡因療效影響的相關機制還需進一步研究。

3.2 咖啡因代謝相關基因多態性

3.2.1CYP1A2基因CYP1A2基因 屬 于細胞色素P450（cytochrome P450，CYP）酶系基因家族，位于染色體15q24.1上，長約7.7 kb，包含7個外顯子和6個內含子，表達細胞色素酶系中CYP1A2酶。咖啡因由肝臟中CYP1A2、CYP2E1 酶代謝，經去甲基作用生成副黃嘌呤、茶堿和可可堿，其中CYP1A2酶占到了代謝的90%，并負責84%副黃嘌呤、12%茶堿和4%可可堿的代謝［16］。已經報道的CYP1A2基因功能相關的SNP達40余種，其常見位 點 rs2069514、 rs35694136、 rs2069526 和rs762551等的SNP可以影響酶的活性，進而表現出個體咖啡因代謝水平的差異。如rs762551 位點AA基因型對CYP1A2酶具有更高的誘導性，因而對咖啡因的代謝速率更高［29］。此外，有研究表明，rs2472299 位點的SNP 與咖啡因攝入習慣相關［30］。He等［19］研究發現，在早產兒中，血漿咖啡因水平與CYP1A2基 因rs762551 和rs2472299 位點 的SNP無關。Gao 等［31］對早產兒咖啡因的藥物代謝動力學進行了研究，并且分析了CYP1A2基因的多態性和咖啡因藥物代謝的相關性，結果發現CYP1A2基因 多 態 性（rs2069514、 rs2069521、 rs2069526、rs2470890、rs35694136、rs3743484、rs56107638和rs762551）不影響咖啡因的藥物代謝過程。

研究表明，CYP1A2 酶在新生兒期無顯著表達，1～3 月齡時只有成人的10%～15%［32］。早產兒由于肝酶系統發育的不成熟，咖啡因基本不經過肝臟清除，因此CYP1A2基因的多態性不影響咖啡因在早產兒中的代謝，對咖啡因的療效也沒有顯著的相關性。

3.2.2AHR基因AHR基因為芳香烴受體基因，位于染色體7p21.1上，長約47 kb，由11個外顯子組成。AHR基因表達的芳香烴受體（arylhydrocarbon receptor，AHR）由848個氨基酸組成，作為1 種轉錄因子調節CYP1A1和CYP1A2基因的表達。AHR基因在胎盤、肺、胸腺、腎臟和肝臟中高度表達。全基因組關聯研究已經確定AHR基因的SNP 與咖啡因攝入量相關［33］。如歐洲人種咖啡因攝入量在rs4410790 位點不同基因型中存在顯著差異，同時此位點的SNP 已經被證明影響咖啡因的去甲基化代謝過程［34］。He等［19］與Guo等［35］研究發現AHR基因rs4410790 和rs1476080 位點SNP 與咖啡因療效有關（P＜0.05）。如前所述，CYP1A2 酶在新生兒期基本不參與咖啡因的代謝，因此AHR基因可能不通過CYP1A2 酶的代謝途徑來影響咖啡因療效。然而，AHR 在支氣管、細支氣管和肺泡上皮細胞中高表達，參與呼吸功能的調節。AHR 缺乏會下調介導器官發育和細胞增殖的基因，上調增加炎癥的基因，影響肺的發育。此外，AHR 信號通路在保護新生小鼠和胎兒肺微血管內皮細胞免受高氧損傷中發揮重要作用［36］。因此AHR 信號通路可能通過影響早產兒肺功能而間接影響咖啡因療效。

3.3 與咖啡因作用相關的其他基因多態性

3.3.1PDE4D基因PDE4D基因屬于磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）系基因家族，位于染色體5q11.2‐q12.1上，長約617 kb，包含39個外顯子，編碼PDE4D 酶。咖啡因是第1個被確定的PDE 抑制劑，可非選擇性拮抗此酶，減少第二信使環磷酸腺苷的濃度，增加細胞內Ca2+的釋放，拮抗γ‐氨基丁酸A型受體。現普遍認為生理濃度的咖啡因不發揮PDE 的抑制作用，因此與治療AOP 的關系不大［28］。但有研究發現，咖啡因療效與PDE4D基因rs10075508 位點多態性有關，攜帶TT基因型對咖啡因治療無反應（P=0.032）［19］。此基因位點與咖啡因療效的相關性需更大樣本的研究進一步論證，對其機制也需進一步探究。

3.3.2ADA基因ADA基因為腺苷脫氨酶基因，位于染色體20q13.12 上，長約32 kb，包含12個外顯子，編碼腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）。人體內腺苷由ADA 脫氨生成肌酐而被清除。ADA可通過與腺苷受體A1、A2a、A2b結合而影響腺苷受體的可用性［37］。研究表明，ADA 活性受到ADA基因多態性的影響，如rs73598374 位點G到A的突變導致ADA的活性降低，在GA基因型個體中，ADA 活性下降20%～30%，而攝入咖啡因可以作為ADA基因多態性功能效應的調節劑進而影響ADA 的功能［38］。He 等［19］研究發現，咖啡因治療AOP 的療效在ADA基因rs521704 位點不同基因型中表現出了顯著差異，CA和CC基因型對咖啡因反應較好（P＜0.05）。因此ADA基因多態性可能與咖啡因療效相關，由于相關研究尚少，需要在更大樣本、不同種群的研究中加以論證。

3.3.3CLOCK基因CLOCK基因為晝夜節律基因，位于染色體4q12，長約118 kb，由28個外顯子組成，編碼CLOCK 蛋白。CLOCK 蛋白由846個氨基酸組成，與芳香烴受體核轉錄蛋白樣1形成異二聚體，控制內源性晝夜節律系統。CLOCK基因的常見SNP（次要等位基因頻率≥1%）在非洲人中有406個，歐洲人中有271個，亞洲人中有278個，美洲大陸人中有277個［39］，這些SNP 的遺傳變異引起生理變化，進而導致睡眠結構和對精神疾病的易感性改變。如rs1801260 位點的SNP 影響CLOCK基因mRNA 的表達、功能和穩定性，與晝夜節律紊亂相關，rs12649507位點G等位基因攜帶會增加睡眠障礙風險［40-41］。晝夜節律的調控在人體細胞內普遍存在，有研究表明晝夜節律與藥物在組織的循環和分布有關，影響組織對藥物的反應［42］。咖啡因通過拮抗腺苷受體而促進覺醒，干擾睡眠，并調節CLOCK基因的表達而影響晝夜節律［43］。Guo 等［35］的研究發現包括rs12649507 在內的18個CLOCK基因位點SNP與咖啡因療效顯著相關。因此晝夜節律可能對咖啡因的療效起著關鍵作用。此外，與咖啡因代謝相關的AHR 同樣是調節晝夜節律周期的關鍵因子，和CLOCK 晝夜節律信號通路相互作用［44］，共同對咖啡因的療效產生影響，其機制還需進一步探索。

4 小結

AOP 這種與發育相關的疾病也具有遺傳學因素，咖啡因是目前應用最廣泛的治療藥物，其療效受到遺傳因素的影響，與多種基因SNP 密切相關，但具體機制尚未完全明確。目前國內外研究尚處于起步階段，未來需對AOP 的易感基因進行探索，以及開展更為全面的影響咖啡因療效相關基因多態性研究，以揭示AOP 發病和治療的遺傳學機制，對攜帶AOP 不同易感基因的早產兒進行干預，并優化咖啡因在早產兒中的應用，進一步提高治療效果，改善早產兒預后。