鄰近標(biāo)記技術(shù)APEX2的發(fā)展與應(yīng)用

羅思，丁明

（中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 211198）

研究活細(xì)胞細(xì)胞器和亞細(xì)胞區(qū)域的蛋白質(zhì)組有助于理解細(xì)胞中組織和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，因此興起了許多方法。基于鄰近標(biāo)記的方法結(jié)合質(zhì)譜（MS）的蛋白質(zhì)組的系統(tǒng)分析為研究蛋白質(zhì)的相互作用提供了一種高通量的方法。近年來，研究蛋白質(zhì)相互作用的鄰近依賴標(biāo)記技術(shù)也取得了很大發(fā)展。目前用于鄰近標(biāo)記技術(shù)的酶主要有3種：辣根過氧化物酶（HRP）、鄰近依賴的生物素鑒定（BioID）和工程抗壞血酸過氧化物酶（APEX）。雖然第一個基于生物素鄰近標(biāo)記的研究是利用HRP和芳基疊氮生物素做底物進行的[1]，但是HRP在哺乳動物細(xì)胞質(zhì)中并不活躍。在細(xì)胞質(zhì)的還原環(huán)境中，HRP的4個二硫鍵和2個Ca2+離子結(jié)合位點會被破壞，不能穩(wěn)定維持自身結(jié)構(gòu)[2]。這一缺陷限制了其在細(xì)胞內(nèi)相互作用方面的使用，因此HRP逐漸退出蛋白質(zhì)相互作用研究的舞臺。基于BioID的鄰近標(biāo)記采用了來自大腸桿菌的生物素連接酶BirA的突變形式，利用質(zhì)譜檢測BirA修飾生物素化蛋白，可以鑒定出與感興趣蛋白相互作用的微弱或者短暫的蛋白質(zhì)，目前這種技術(shù)已成功用于天然環(huán)境中相互作用伙伴的生化篩選[3-5]。然而在BirA標(biāo)記過程中，BirA的產(chǎn)物——生物素-腺苷酸酯的半衰期長達(dá)數(shù)分鐘，以至于它導(dǎo)致的標(biāo)記半徑偏大，得到的結(jié)果假陽性偏多。此外BirA標(biāo)記的速度很慢，通常需要18～24 h，因此很難研究高度動態(tài)的蛋白質(zhì)相互作用。因此BioID技術(shù)不能很好地運用于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中蛋白質(zhì)相互作用，為了提高空間和時間的特異性，APEX2技術(shù)則被開發(fā)出來[6-7]。隨著APEX2技術(shù)的不斷拓展，越來越多的科學(xué)家開始利用APEX2技術(shù)來解決一些以前難以研究的問題，例如亞細(xì)胞器中蛋白質(zhì)的定位與分析、某些存在爭論的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)以及動態(tài)蛋白質(zhì)復(fù)合物的識別與鑒定等。本文主要對APXE2技術(shù)進行總結(jié)與歸納，闡述其作用原理及APXE2技術(shù)在不同類型的相互作用的蛋白質(zhì)組的應(yīng)用。

1 APEX2技術(shù)的策略

1.1 工程抗壞血酸過氧化物酶（APXE2）

抗壞血酸過氧化物酶（APX）是一種I類胞質(zhì)植物過氧化物酶，與HRP不同，由于缺乏二硫鍵和鈣離子，所以能夠在還原環(huán)境中保持天然的活性[8]。野生型的APX并未在哺乳動物細(xì)胞中進行測試，并且其天然底物抗壞血酸鹽的結(jié)構(gòu)與二氨基聯(lián)苯胺（DAB）基本不相同，加上APE是同型二聚體，嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)的天然定位和功能[9-10]，導(dǎo)致APE的適用性不大。隨后MARTELL等[11]在APE基礎(chǔ)上進行改造，最終得到一種名為APEX的單體抗壞血酸過氧化物酶；相對于APE而言，APEX不僅缺乏二硫鍵和鈣結(jié)合位點，可以在還原性的胞質(zhì)環(huán)境中表達(dá)而不失去活性，并且其活性得到很大改善。經(jīng)過改造過后的APEX，可以用于電子顯微鏡（EM）的細(xì)胞內(nèi)特異性蛋白質(zhì)成像[11]和空間分辨蛋白質(zhì)組學(xué)定位成像[6-7]。然而APEX在使用過程中有一個很大缺陷——低靈敏度。當(dāng)APEX表達(dá)量低時，其功能受到很大的局限性。因此LAM等[12]通過酵母展示和定向進化技術(shù)，在APXE的基礎(chǔ)上進行隨機突變，最終得到一種A134P的突變體，并命名為APEX2。它相對于APEX而言，具有相同的化學(xué)性質(zhì)，但是其催化活性和表達(dá)量得到很大改善。由于APEX2標(biāo)記過程產(chǎn)生的生物素-苯氧基自由基是短壽命的（＜1 ms），能夠產(chǎn)生一個較小的標(biāo)記半徑（＜20nm），因此APEX2標(biāo)記能夠提供更高的空間和時間特異性。為了解決對依賴于相互作用的鄰近標(biāo)記工具的需求，HAN等[13]也在APEX2的基礎(chǔ)上，對其進一步定向進化改造，得到了一種叫做分裂的APEX（sAPEX），sAPEX技術(shù)擴展了鄰近標(biāo)記的方法，具有更高的時空分辨率，將基于APEX方法的效用擴展到生物學(xué)的新領(lǐng)域。

1.2 APEX2的技術(shù)原理

APEX2技術(shù)原理可以分為兩大方向：①APEX2能夠在細(xì)胞內(nèi)形成電子密度高的鋨，然后通過EM進行結(jié)構(gòu)的判斷。活細(xì)胞可以在二氨基聯(lián)苯胺（DAB）和雙氧水（H2O2）的溶液中固定，APEX2可以催化DAB的聚合和局部沉積，隨后吸收電子密度較高的鋨，最后形成對比，最后用EM可視化APEX2的表達(dá)結(jié)構(gòu)[11]。②APEX2能夠在通過生物素化鄰近蛋白質(zhì)，從而進行蛋白質(zhì)組學(xué)的分析。APEX2酶能夠在H2O2的存在下，將生物素-苯酚（BP）氧化成極短壽命（＜1 ms）和高度活性的自由基，然后它們可以共價連接到在鄰近的內(nèi)源性蛋白質(zhì)中的富含電子的側(cè)鏈氨基酸殘基上，從而對底物進行生物素標(biāo)記[6，11]。通過去除H2O2和加上淬滅緩沖液，可以中止標(biāo)記反應(yīng)，然后可以利用鏈霉親和素的珠子分離得到生物素化蛋白，并通過質(zhì)譜進一步分析[6-7]。

2 APEX2技術(shù)的應(yīng)用

2.1 在不同細(xì)胞器和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)域中蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用

細(xì)胞器蛋白質(zhì)組和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)域的表征對于理解細(xì)胞組織、識別蛋白質(zhì)復(fù)合物以及蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)是必不可少的。APEX2技術(shù)介導(dǎo)的鄰近標(biāo)記最早是由RHEE及其同事發(fā)現(xiàn)，其目的是規(guī)避傳統(tǒng)的線粒體純化的局限性和實現(xiàn)細(xì)胞器蛋白質(zhì)組定位的時空特異性[6]。由于生物素-苯氧基自由基不具有膜透性，APEX2技術(shù)非常適合用于膜封閉的亞細(xì)胞室的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，例如線粒體基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、自噬體等結(jié)構(gòu)。線粒體由外膜（OMM）、內(nèi)膜（IMM）以及線粒體基質(zhì)組成。線粒體基質(zhì)是IMM所包圍的內(nèi)部的亞細(xì)胞器區(qū)域，位于OMM和IMM之間的區(qū)域稱為膜間空間（IMS）。為了檢測APEX在蛋白質(zhì)組學(xué)上的標(biāo)記能力，RHEE等將線粒體基質(zhì)靶向APEX用于人胚腎細(xì)胞（HEK），并結(jié)合雙態(tài)SILAC標(biāo)記和MS進行相對定量，最終495個蛋白被鑒定為線粒體基質(zhì)蛋白，其中94%的蛋白質(zhì)有線粒體注釋，另外6%被認(rèn)為是新的線粒體蛋白。此外一些先前被認(rèn)為存在于IMS或OMM的蛋白質(zhì)，包括原卟啉原氧化酶，被APEX技術(shù)得到的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)重新分配到線粒體基質(zhì)的歸屬，并且通過電子顯微鏡證實。RHEE等的研究充分展示了APXE技術(shù)在面對基質(zhì)的內(nèi)膜蛋白和膜間空間（IMS）之間具有特別的特異性和區(qū)別。APEX介導(dǎo)的蛋白質(zhì)組映射的特異性，結(jié)合其易用性，為生物學(xué)家了解活細(xì)胞的分子組成提供了一個強有力的工具。

隨后HUNG等[7]通過對線粒體IMS的研究，進一步證實APEX技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)空間和時間特異性蛋白質(zhì)組的映射。此外APEX2也已經(jīng)成功地應(yīng)用于線粒體外膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜[14]和自噬體內(nèi)腔[15]中蛋白質(zhì)組的研究。APEX2技術(shù)除了應(yīng)用于這幾個膜細(xì)胞器的研究外，有科學(xué)家將APEX2技術(shù)也成功應(yīng)用于細(xì)胞核中蛋白質(zhì)組學(xué)的研究[16]。核層（NL）是位于內(nèi)部核膜下的細(xì)胞核的一個亞結(jié)構(gòu)。NL的主要結(jié)構(gòu)成分是中間絲蛋白，分為A型和B型。TRAN等[17]通過將APEX2融合到NL-B1蛋白中，成功地識別出NL近端蛋白、RNA、DNA。APEX的應(yīng)用并不局限于膜封閉的細(xì)胞器的分析，它已成功地用于分析非膜封閉的細(xì)胞器的蛋白質(zhì)組，如原發(fā)性纖毛[18]。

除了成功利用APEX技術(shù)來分析細(xì)胞器蛋白質(zhì)組學(xué)分析外，APEX還為鑒定相互作用的蛋白質(zhì)提供了一個很好的工具。例如將APEX2與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Ca2+傳感器STIM1融合，在活細(xì)胞中能夠很好地映射內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞膜連接的蛋白質(zhì)組，也鑒定出STIM激活的增強子TMEM110（STIMATE）[19]。BERSUKER等[20]也將APEX2應(yīng)用于脂滴相互作用的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，這種方法不僅鑒定到許多之前驗證過的脂滴蛋白，也揭示了新的脂滴蛋白，并且還能通過APEX2技術(shù)對脂滴動態(tài)蛋白質(zhì)組學(xué)進行研究，揭示其調(diào)控機制。KE等[21]也是在APEX2的基礎(chǔ)上，通過對修飾的酚羥基結(jié)構(gòu)進行設(shè)計，得到了高標(biāo)記特異性的生物素-苯酚類似物，也同樣展示出APEX2技術(shù)能夠很好地應(yīng)用于在活細(xì)胞內(nèi)相互作用蛋白質(zhì)的分析。

2.2 在蛋白質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)鑒定中的應(yīng)用

除鑒定相互作用蛋白外，APEX2技術(shù)同樣具備強大的定位功能。Sigma-1受體（S1R）主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER），作為一個多能的細(xì)胞內(nèi)信號分子，在細(xì)胞中有多種作用，包括離子通道調(diào)節(jié)、應(yīng)激信號和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，然而，這種蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的基本拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)仍然存在爭議。由于關(guān)于ER膜中S1R蛋白確切拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的報道相互矛盾，MAⅤYLUTOⅤ等[22]應(yīng)用APEX2技術(shù)，在全長S1R蛋白的N端或者C端連上APXE2，再利用APEX2技術(shù)能夠在細(xì)胞內(nèi)形成電子密度高的鋨，然后通過EM進行結(jié)構(gòu)判斷的原理，最終確定了全長S1R的N端面對細(xì)胞質(zhì)，而C端面對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，成功地解決了Sigma-1受體N端和C端的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的問題，展示出APXE2技術(shù)在爭論的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)上的強大定位功能。

2.3 在RNAs蛋白相互作用分析中的應(yīng)用

APEX2不僅可以研究蛋白質(zhì)的相互作用，還可以應(yīng)用于分析細(xì)胞內(nèi)RNAs的空間環(huán)境和RNA蛋白相互作用。不同的核糖核蛋白復(fù)合物控制mRNA的加工、翻譯和衰變。這些復(fù)合物中的轉(zhuǎn)錄本定位于細(xì)胞的特定區(qū)域，并可以凝結(jié)成非膜結(jié)合結(jié)構(gòu)，如應(yīng)激顆粒。然而，事實證明，繪制這些大型動態(tài)結(jié)構(gòu)的RNA組成具有挑戰(zhàn)性。2019年，PADRóN等[23]利用APEX2技術(shù)，開發(fā)了一種名為APEX-seq的技術(shù)，解決了RNAs的定位問題，并且還鑒定出關(guān)鍵的RNAs結(jié)合蛋白。將空間轉(zhuǎn)錄組（如APEX-seq所揭示的）與空間蛋白質(zhì)組（如APEX-質(zhì)譜所確定的）進行匹配，精確地平行獲得，為研究活性mRNA的翻譯起始復(fù)合物的組織結(jié)構(gòu)和應(yīng)激顆粒組成提供了新的見解。APEX2技術(shù)允許一個強大的和通用的方法來探索大分子的空間環(huán)境。2020年，HAN等[24]也利用MS2-MCP系統(tǒng)和設(shè)計的CRISPR-Cas13系統(tǒng)將APEX2以高特異性靶向人端粒酶RNA hTR，在1 min的鄰近生物素化過程中，捕獲了hTR的候選結(jié)合伙伴，發(fā)現(xiàn)了12未鑒定過的hTR結(jié)合蛋白。MS2-和Cas13靶向的APEX2技術(shù)有助于發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞中新的RNA蛋白相互作用。

2.4 在體內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用

除了細(xì)胞水平外，APEX2技術(shù)也同樣適用于體內(nèi)研究。CHEN等[25]通過構(gòu)建mito-APEX，成功地將APEX2技術(shù)用于表征活果蠅肌肉細(xì)胞中的線粒體基質(zhì)蛋白質(zhì)組，實現(xiàn)了APEX2在體內(nèi)的研究。利用APEX2技術(shù)建立了活果蠅組織的蛋白質(zhì)組定位平臺，一旦激活，APEX2酶催化鄰近內(nèi)源性蛋白質(zhì)的生物素化，然后可以被分離并被質(zhì)譜鑒定。APEX2技術(shù)在果蠅不同亞細(xì)胞室的多個組織中具有有效的標(biāo)記功能，并繪制了果蠅肌肉線粒體基質(zhì)蛋白質(zhì)組圖，進一步證明APEX2技術(shù)在活細(xì)胞亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組表征方面的能力。

此外APEX2也已被進一步應(yīng)用于酵母細(xì)胞，利用優(yōu)化過的APEX2技術(shù)，HWANG等[26]在酵母細(xì)胞中鑒定出一個新的高爾基定位的蛋白酶Rbd2的結(jié)合蛋白——Cdc48，并表明該蛋白在Rbd2識別SREBP中的發(fā)揮作用。SINGER-KRüGER等[27]也在酵母細(xì)胞中，通過APEX2技術(shù)結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)中氨基酸的穩(wěn)定同位素標(biāo)記（SILAC），很好地展示膜封閉和半開放室、線粒體基質(zhì)和細(xì)胞核的蛋白質(zhì)組圖譜，并發(fā)現(xiàn)了一個全新的蛋白Yer156C。

3 總結(jié)

作為一種鄰近標(biāo)記技術(shù)，APEX2技術(shù)不僅可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)相互作用的鑒定，也實現(xiàn)了亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中蛋白質(zhì)組學(xué)定位以及瞬時、動態(tài)的蛋白質(zhì)復(fù)合物的識別，使得APEX2技術(shù)被越來越多的人所接受。APEX2技術(shù)能追蹤細(xì)胞內(nèi)瞬時的、動態(tài)的分子間相互作用，更好地繪制分子間相互作用圖譜，獲得更為深入全面的生物學(xué)信息。相信在不久的將來，APEX2技術(shù)能夠成為研究生命科學(xué)問題主流手段。