土壤中抗生素產生菌的分離、鑒定及抗菌活性分析

王淑娟 高翠娟 劉晶晶

（臨沂大學生命科學學院，山東 臨沂 276000）

0 引言

植物病害不僅會影響農作物的產量，降低農作物的品質，還不利于農產品的貯藏、加工和運輸，給農民帶來巨大損失，嚴重威脅我國糧食安全［1］。雖然目前應用化學農藥是防治植物病害的一種有效方法，但長期、大量使用化學農藥不僅會影響植物生長，還會在使用過程中對環境造成污染。隨著生活水平的提高，人們越來越重視食品安全和環境保護，對綠色食品要求越來越高，需求量越來越大。而相對于化學農藥，農用抗生素具有低毒、高效、無污染、選擇性強和安全性高等優勢，顯然更符合未來植物病害防治的藥物應用要求［2-3］。此外，抗生素在藥品的開發與應用方面同樣具有廣闊的前景。人類發展至今從未擺脫過疾病的困擾，且近年來隨著環境的惡化和藥品的濫用，部分致病菌的耐藥性日益增強，新型感染性疾病不斷產生與傳播，人類面臨的疾病威脅越來越多，因此，加快新型高效抗生素的開發十分重要［4］。

土壤中含有豐富的微生物資源。相關研究表明，每克土壤含微生物106～109個，其中細菌數量最多，放線菌的數量僅次于細菌［5］。土壤中部分微生物能產生抗生素、抗真菌劑和免疫抑制劑等多種有用的次生代謝物，如放線菌群和少部分絲狀真菌［6］。放線菌是介于細菌與絲狀真菌之間而又接近于細菌的一類絲狀原核生物，因其能產生大量抗生素的特性，近年來在微生物及抗菌領域廣受關注。放線菌種類很多，常見的主要有兩類：一類是其結構組成中沒有大量菌絲體，如諾卡氏放線菌；另一類是由大量菌絲體組成的鏈霉菌屬［7］。因為鏈霉菌在日常生活中較為常見，其數量占已發現菌種的25%以上，所以也被稱為常見放線菌。雖然當前被利用的抗生素大多是由放線菌產生的，但被分離出來的放線菌卻很少，僅有0.1%～0.5%，還有很多抗生素產生菌未被發現或分離出來［8-11］。

此次研究從校園土壤中分離抗生素產生菌，對分離出的抗生素產生菌進行菌種鑒定，并通過抑菌試驗分析從土壤中分離出的抗生素產生菌對細菌和真菌的抑菌作用，以期進一步探索抗生素產生菌的抑菌作用，為抗生素產生菌的研究提供更多的理論依據。

1 試驗材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤取自山東省臨沂市臨沂大學校園內。

1.2 指示菌

指示菌為研究團隊所在的膜蛋白與藥物工程實驗室保存的副溶血球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、沙門氏菌、釀酒酵母、糞鏈球菌和蠟樣芽孢桿菌。

1.3 培養基

高氏1號培養基：可溶性淀粉20.00 g/L、硝酸鉀1.00 g/L、氯化鈉0.50 g/L、磷酸氫二鉀0.50 g/L、硫酸鎂0.50 g/L、硫酸亞鐵0.01 g/L、瓊脂15.00 g/L，pH值7.1～7.5。LB固體培養基：蛋白胨10.00 g/L、肉提取物3.00 g/L、乳糖5.00 g/L、溴麝香草酚藍0.024 g/L，pH值為6.8～7.2。YPD培養基：酵母膏10.00 g/L、葡萄糖20.00 g/L、蛋白胨20.00 g/L、瓊脂15.00 g/L。

1.4 抗生素產生菌的分離純化

1.4.1 土壤取樣。采用五點交叉取樣法在營養豐富的土壤中取樣。去除表層約2 cm厚的土壤，然后挖取深度在2～10 cm處的土壤，除去雜物（如礫石、殘根等），將土樣裝入燒杯中。土樣取回后立即進行后續試驗。

1.4.2 制備懸液及梯度稀釋。用電子天平稱取1.00 g土壤樣品，倒入錐形瓶中，加入99 mL無菌水，輕輕搖晃錐形瓶10～20 min，使菌體分布均勻，將錐形瓶標記為10-2g/mL質量濃度的菌懸液，靜置0.5 min。再準備4支無菌試管，并在試管上貼上標簽紙，對其編號，標簽的編號依次為10-3、10-4、10-5、10-6g/mL。在標簽為10-3g/mL的試管中，加入4.5 mL無菌水，再加入0.5 mL濃度為10-2g/mL的土壤菌懸液，并用吹吸管吹吸三四次，使菌懸液充分混勻，即得到質量濃度為10-3g/mL的土壤稀釋液。10-4、10-5、10-6g/mL質量濃度的土壤稀釋液也按此方法配制。需要注意的是，操作過程應嚴格，防止受到雜菌的污染。

1.4.3 稀釋倒平板法分離土壤中目的菌株。分別 取 10-3、10-4、10-5g/mL菌 懸 液1 mL注 入 平 板培養皿內，每個梯度兩個平板。取出已配制好的高氏1號培養基，在微波爐中加熱使其融化，待其溫度冷卻至45～50 ℃后倒入培養皿內，微微晃動，使菌落分散均勻；待其凝固后，將平板倒扣在恒溫箱中，28 ℃培養7 d，觀察菌落產生情況，并做好記錄。

1.4.4 目的菌株菌落的純化。挑取培養皿上質地緊密、表面呈絨狀的菌落或干燥、褶皺、較小的單菌落，接種于高氏1號培養基上進行分離純化，在培養箱內28 ℃培養7 d，觀察菌落表面的形態特征。

1.5 抗菌譜測定

將配制好的LB固體培養基在微波爐中進行加熱，待其冷卻至室溫后倒入培養皿內。待培養基冷卻凝固后，用涂布棒將指示菌涂布在培養基上。挖取適量已純化的目的菌株置于培養基分區的中央，培養1 d后，觀察抑菌圈形成情況。

1.6 菌株16S rDNA和18S rDNA序列測定和分析

用細菌引物和真菌引物分別對7種菌株進行PCR擴增，然后進行序列分析。

1.6.1 基因組DNA的提取。采用基因組DNA抽提試劑盒（Ezup柱式）分別提取目的菌株基因組。

1.6.2 PCR擴增。菌種鑒定所用引物如表1所示。PCR反應體系如表2所示。PCR反應程序如表3所示，共進行30個循環。

表1 菌種鑒定所用引物及其序列

表2 PCR反應體系

表3 PCR反應程序

1.6.3 序列測定和分析。將擴增產物用DNA膠回收試劑盒（SanPrep柱式）進行純化，純化后的目的片段立即送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將得到的序列用GenBank數據庫的BLAST程序進行序列比較分析。

2 試驗結果與分析

2.1 土壤中抗生素產生菌菌株的分離純化

挑選從土壤中篩選出的單菌落，以蠟樣芽孢桿菌或大腸桿菌為指示菌進行初篩，共篩選出25株抑菌效果明顯的菌株。通過分離純化和分析菌絲形態，發現25株菌株屬于7種不同類型菌種，分別編號為S1～S7（見圖1）。

圖1 土壤中篩選出的7種抗生素產生菌

2.2 16S rDNA與18S rDNA的擴增與菌種鑒定

提取7種菌株的基因組DNA，分別使用16S rDNA、18S rDNA引物進行PCR擴增，PCR結果如圖2所示，菌株S1和S2為真菌，S3～S7為細菌。

圖2 菌株S1～S7的16S rDNA、18S rDNA擴增結果

將純化后的目的片段進行測序，得到的DNA序列用BLAST程序進行比較分析，結果如表4所示，7種菌株的形態特征與相關文獻描述相符。

表4 7種菌株的鑒定結果

2.3 抗生素產生菌抑菌性分析

為檢測7種菌株的抑菌效果，以實驗室保存的8種菌株作為指示菌進行抑菌活性分析，結果如表5所示。

表5 7種菌株抑菌活性測定結果

由表5可知，S1、S4、S5、S6、S7菌株對金黃色葡萄球菌生長有較強抑制作用；蠟樣芽孢桿菌可被除S2以外的其余菌株抑制；S2、S6菌株對大腸桿菌生長有抑制作用；S3、S4、S6、S7菌株對糞鏈球菌生長有抑制作用；S4、S7對釀酒酵母生長有抑制作用；菌株S1～S7對綠膿桿菌、沙門氏菌和副溶血球菌的生長均沒有明顯的抑制作用。

3 結論與討論

土壤中的微生物既存在互惠互利關系，也有敵對關系。土壤中能夠產生抗生素的抗性微生物，不僅可抑制病原微生物的生長繁殖，還能防止和減少病原微生物對農作物造成的侵害。通過研究篩選出了7種能產生不同抗生素的菌株，為下一步研究抗生素產生菌的生產性能和新藥劑的開發創造了條件。此外，目前關于部分菌株如產紅青霉、山丘鏈霉菌、墨西哥鏈霉菌和華麗黃鏈霉菌的報道還較少。研究發現，產紅青霉、山丘鏈霉菌、墨西哥鏈霉菌和華麗黃鏈霉菌能抑制多種細菌或真菌生長，這為抗生素產生菌的研究提供了新的方向。