生物胺類物質(zhì)藥理及理化測(cè)定方法研究進(jìn)展

林新麗，吳殷囡，譚力，孟長(zhǎng)虹，汪玉馨*，史清水*（.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，南京2009；2.中國藥科大學(xué)藥物分析教研室，南京 298；.江蘇鼎泰藥物研究股份有限公司，南京 2800）

生物胺廣泛存在于自然界中，其可由游離氨基酸經(jīng)脫羧酶催化脫羧產(chǎn)生，也可以由醛酮類化合物氨基化脫氨基產(chǎn)生。內(nèi)源性生物胺在體內(nèi)發(fā)揮著基本的生理功能，如參與免疫炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)血壓，調(diào)控血糖，促進(jìn)遺傳物質(zhì)的合成等，但其在體內(nèi)過度蓄積則會(huì)損害人體神經(jīng)系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)，引起不良反應(yīng)。同時(shí)由于許多復(fù)雜基質(zhì)藥物如中藥、抗菌藥物、生化藥物等都提取自動(dòng)植物體，其生產(chǎn)、發(fā)酵和儲(chǔ)藏過程中可能引入或分解產(chǎn)生生物胺，如在體內(nèi)疊加或蓄積，均有可能對(duì)臨床用藥安全造成風(fēng)險(xiǎn)，因此需通過建立可靠的檢測(cè)方法，對(duì)藥物中的生物胺類物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)控，明確各生物胺的量效關(guān)系，擬訂適宜的控制策略，從而提高臨床用藥的安全性。

1 生物胺的研究概況

從生物胺的來源可知，其結(jié)構(gòu)由上級(jí)化合物決定，具有多樣性，不同結(jié)構(gòu)的生物胺具有不同的功能，其中組胺的研究最受關(guān)注，其他種類的生物胺研究報(bào)道較少。相較而言，生物胺在食品領(lǐng)域研究較多，而在藥品領(lǐng)域相關(guān)研究較少，故亟需在藥品領(lǐng)域建立適宜的分析測(cè)定方法，并進(jìn)行質(zhì)量控制及研究。為了更好地了解各類生物胺的研究現(xiàn)狀，本文先對(duì)不同種類生物胺的特性進(jìn)行匯總。

1.1 生物胺的分類及質(zhì)量控制

生物胺可被看作氨分子上的氫被不同基團(tuán)取代，如脂肪基團(tuán)、芳香基團(tuán)或雜環(huán)烴基團(tuán)等。根據(jù)結(jié)構(gòu)分類，常見的組胺屬于雜環(huán)胺類；酪胺、苯乙胺、章魚胺等被列為芳香族胺；腐胺、尸胺、精胺、亞精胺等被列為脂肪族胺。根據(jù)其構(gòu)成分類，組胺、酪胺、苯乙胺等被列為單胺；胍丁胺、尸胺、腐胺及亞精胺等被列為多胺，見表1。

研究表明，部分食源性疾病的公共衛(wèi)生問題與生物胺類物質(zhì)有關(guān)，在歐洲和美國多達(dá)40%的病例報(bào)告可歸因于組胺過量，表1所列幾種常見的生物胺均可在食品中檢出，其含量是評(píng)價(jià)食物新鮮度的指標(biāo)之一。因此，不同國家和地區(qū)對(duì)食品中的部分生物胺含量制訂了限值，以保障食品的安全，特別是生鮮魚類、罐頭及發(fā)酵產(chǎn)品等，還明確了生產(chǎn)過程和終產(chǎn)品中生物胺的含量限值。但是不同地區(qū)限值標(biāo)準(zhǔn)差異顯著，標(biāo)準(zhǔn)中，組胺限值最低為50 μg·g，最高可達(dá)400 μg·g，甚至同種食品不同地區(qū)的組胺限值差距較大，例如金槍魚中的組胺限值最低為50 μg·g，限值最高為200 μg·g。

表1 幾種常見的生物胺
Tab 1 Several common biogenic amines

名稱 分子式 結(jié)構(gòu)式 相對(duì)分子質(zhì)量苯乙胺C8H11N NH2 121.18酪胺 C8H11NO NH2 HO 137.18組胺 C5H9N3 NH2 HN N 111.14色胺 C2H12N2 H2N NH 160.21章魚胺C8H11NO2 HO HO NH2 153.17尸胺 C5H14N2 H2N NH2 102.18腐胺 C4H12N2 H2N NH2 88.15亞精胺C7H19N3 H2N NH NH2 145.20精胺 C10H26N4 H2N NH HN NH2202.34胍丁胺C5H14N4 NH2 NH H2N NH 130.79

當(dāng)然，生物胺限值制訂存在一定困難，影響因素較多，比如腸道分解生物胺的效率、耐受性等均存在個(gè)體差異性，不同生物胺協(xié)同作用從而存在毒性疊加的可能性等。因此，有必要對(duì)多種生物胺的不良反應(yīng)進(jìn)行深入研究，明確其藥理活性與不良反應(yīng)的量效關(guān)系，從而為其限值的制訂提供基礎(chǔ)和佐證。

1.2 生物胺類物質(zhì)的不良反應(yīng)

雖然生物胺在調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、控制生長(zhǎng)代謝和穩(wěn)定生物膜等方面具有積極作用，但其也可引起如心悸、腹瀉、偏頭痛等不良反應(yīng)。其中雜環(huán)胺類化合物組胺的不良反應(yīng)最為常見，其可激動(dòng)受體亞型（H、H和H受體）進(jìn)而引起全身效應(yīng)。H受體的激活會(huì)導(dǎo)致過敏反應(yīng)，發(fā)作迅速；H、H受體的激活會(huì)擴(kuò)張小動(dòng)脈和小靜脈，外周阻力降低，外周血管和毛細(xì)血管擴(kuò)張，回心血量減少，血壓快速下降，常見表現(xiàn)即為低血壓；H受體的激活則會(huì)促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)釋放，與多種中樞神經(jīng)疾病聯(lián)系密切，嚴(yán)重時(shí)可損傷中樞神經(jīng)，表現(xiàn)為惡心、嘔吐和頭痛。

部分芳香族生物胺具有血管收縮作用，酪胺、苯乙胺、色胺和章魚胺能夠使交感神經(jīng)系統(tǒng)釋放去甲腎上腺素，刺激血管平滑肌，血壓上升。高水平的酪胺可引起的中毒癥狀與組胺類似，具體表現(xiàn)為心律加快、呼吸頻率增加和偏頭痛，長(zhǎng)期攝入會(huì)干擾葡萄糖穩(wěn)態(tài)，從而升高血糖水平，甚至中毒性腫脹。苯乙胺毒性較強(qiáng)，易引發(fā)偏頭痛和精神類疾病。色胺促進(jìn)5-羥色胺和多巴胺釋放，5-羥色胺具有升壓作用，可引起高血壓。

同屬脂肪族胺的尸胺和腐胺，較組胺和酪胺的生物活性低，具有刺激生長(zhǎng)發(fā)育的作用，但均有一定的腐蝕性和毒性，高水平腐胺和尸胺的中毒癥狀主要有低血壓、心動(dòng)過緩、呼吸困難和四肢輕微麻痹癱瘓。尸胺和腐胺還可增加其他生物胺的毒性，組胺本身在低水平下可能不會(huì)造成毒性，但在高濃度的腐胺和尸胺存在的情況下，組胺相關(guān)代謝酶的活性降低，毒性增強(qiáng)，可致呼吸系統(tǒng)受損，嚴(yán)重時(shí)危害生命。胍丁胺隨環(huán)境的變化會(huì)分解，在胍丁胺酶催化作用下分解為腐胺，腐胺是精胺和亞精胺的前體，存在潛在危害。

低劑量的精胺和亞精胺不會(huì)引起人體的中毒反應(yīng)，中劑量精胺會(huì)使心肌變性，降低血漿鉀水平，高劑量精胺會(huì)使腎功能受損，高劑量亞精胺會(huì)降低體內(nèi)的血漿肌酐、無機(jī)磷酸鹽和鈣，另外，精胺、亞精胺還能與亞硝酸鹽反應(yīng)生成致癌物質(zhì)。

1.3 藥物中的生物胺來源

藥物（如抗菌藥物、中藥注射劑和多肽類生化藥等）中由于物料的來源多提取自動(dòng)植物體，或通過生產(chǎn)、發(fā)酵、儲(chǔ)存過程存在引入生物胺類雜質(zhì)的可能性。雖然人體腸道可分解一定量的生物胺，但生物胺類物質(zhì)蓄積過量會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)。蘇喆等檢測(cè)了三家企業(yè)的鹿瓜多肽注射劑，檢出組胺、苯乙胺、腐胺和尸胺，其中尸胺的濃度較高，范圍在0.265%～0.333%，超過毒性學(xué)關(guān)注閾值（TTC）2類遺傳毒性雜質(zhì)的限值。Li等檢測(cè)了84批牛或豬胸腺中提取的胸腺多肽注射劑，所有樣品中均存在腐胺和亞精胺，多數(shù)樣品中檢出色胺、苯乙胺、尸胺、組胺、酪胺和精胺，少量樣品中檢出多巴胺，其中，組胺含量高的樣品降壓效應(yīng)的不合格率較高，故組胺含量與降壓物質(zhì)密切相關(guān)。牛慧玲等在疏血通注射液中檢出腐胺、尸胺和酪胺，疏血通注射液是以動(dòng)物提取制成的中藥材為原料，動(dòng)物體內(nèi)的組織器官中含有氨基酸，氨基酸脫羧形成生物胺，引起急性降壓的不良反應(yīng)。因此有必要建立生物胺類雜質(zhì)的檢測(cè)方法，對(duì)可能含有或產(chǎn)生生物胺類雜質(zhì)的藥物開展安全性篩查，控制生物胺類雜質(zhì)的限值，以提高此類藥物質(zhì)量，減少不良反應(yīng)的發(fā)生，保證用藥的安全。

2 生物胺類物質(zhì)的藥理學(xué)測(cè)定方法

目前在藥品質(zhì)量控制中，《中國藥典》2020年版針對(duì)組胺類物質(zhì)，設(shè)置降壓物質(zhì)檢查項(xiàng)，通過判斷制劑引起麻醉貓血壓下降的程度或其引起豚鼠離體回腸收縮的程度來考察并控制組胺類物質(zhì)。除此之外，國內(nèi)外研究者還采用了藥理學(xué)測(cè)定方法進(jìn)行生物胺類物質(zhì)量效關(guān)系的測(cè)定，并比較了不同種屬動(dòng)物模型的靈敏度及重現(xiàn)性。

2.1 頸動(dòng)脈直接測(cè)壓法

頸動(dòng)脈直接測(cè)壓法用于降壓物質(zhì)檢查，動(dòng)物麻醉狀態(tài)下在血管內(nèi)插入壓力傳感器測(cè)量血壓，比較組胺對(duì)照品與供試品引起貓的血壓變化程度，判定降壓物質(zhì)是否符合標(biāo)準(zhǔn)。該方法普遍以貓為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，但貓的來源、遺傳背景和寄生蟲攜帶等情況復(fù)雜，近年來有研究者探索其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在降壓物質(zhì)檢查中應(yīng)用的可行性。

嵇揚(yáng)等以比格犬為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，比較了貓和比格犬對(duì)降壓物質(zhì)的靈敏度和重現(xiàn)性，結(jié)果表明比格犬的靈敏度不符合規(guī)定且重現(xiàn)性較貓差，無法用于降壓物質(zhì)檢查；黎家敏等以實(shí)驗(yàn)兔為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，比較了不同品種的實(shí)驗(yàn)兔和貓對(duì)降壓物質(zhì)的反應(yīng)，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)兔對(duì)降壓物質(zhì)不敏感，不同品種的實(shí)驗(yàn)兔降壓作用存在差異，無法用于降壓物質(zhì)檢查。從實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性和經(jīng)濟(jì)角度考慮貓更適用，貓較小動(dòng)物更接近人體，較大動(dòng)物更方便操作，麻醉期間可以保持一定的靈敏度，血管壁堅(jiān)韌不易損壞，便于手術(shù)操作，可反復(fù)使用，適用于對(duì)藥物體內(nèi)作用的分析，心搏力強(qiáng)，血壓恒定，能獲得完好的血壓曲線。

頸動(dòng)脈直接測(cè)壓法優(yōu)點(diǎn)在于是在動(dòng)脈內(nèi)直接進(jìn)行血壓測(cè)定，壓力傳感器插入動(dòng)物血管內(nèi)測(cè)量血壓，所以測(cè)得值準(zhǔn)確性更高；不足之處在于麻醉對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響：不僅麻醉程度具有個(gè)體差異性，麻醉期間動(dòng)物的多項(xiàng)生理指標(biāo)也會(huì)改變，因此，需設(shè)立靈敏度檢測(cè)來衡量在該麻醉?xiàng)l件下實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是否達(dá)到靈敏度要求。

2.2 豚鼠離體回腸法

豚鼠離體回腸法作為頸動(dòng)脈直接測(cè)壓法的補(bǔ)充方法，收錄于《中國藥典》2015年版，通過豚鼠離體回腸給藥，比較組胺對(duì)照品與供試品引起收縮的程度，判定降壓物質(zhì)是否符合標(biāo)準(zhǔn)。

近年來有研究者通過上述兩種方法對(duì)生化藥中的降壓物質(zhì)檢查進(jìn)行比較。王婷婷等以不同濃度組胺對(duì)照品模擬不同水平的樣品，采用貓和豚鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，兩種方法均有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，供試品注射用糜蛋白酶在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)豚鼠離體回腸的收縮反應(yīng)無干擾作用，與頸動(dòng)脈直接測(cè)壓法相比，專屬性和重復(fù)性良好。吳賢生等分別用兩種方法進(jìn)行注射用促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的安全性檢查，根據(jù)《中國藥典》2020年版判定標(biāo)準(zhǔn)，豚鼠離體回腸法檢查組胺類物質(zhì)符合規(guī)定，但是頸動(dòng)脈直接測(cè)壓法檢查卻發(fā)生了明顯降壓反應(yīng)，結(jié)果表明，組胺類物質(zhì)檢查合格仍可能會(huì)出現(xiàn)降壓物質(zhì)檢查不符合規(guī)定的情況。比較兩種方法，豚鼠離體回腸法準(zhǔn)確度良好，且靈敏度更高，可作為頸動(dòng)脈直接測(cè)壓法的補(bǔ)充方法，但不能簡(jiǎn)單以豚鼠離體回腸法來替代頸動(dòng)脈直接測(cè)壓法結(jié)果。

豚鼠離體回腸法優(yōu)點(diǎn)在于專屬性高、反復(fù)給藥重現(xiàn)性較好，豚鼠為常規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，易于購得；但其操作復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件溫度和通氣要求嚴(yán)格，以此方法考查降壓物質(zhì)需用頸動(dòng)脈直接測(cè)壓法復(fù)檢。

2.3 尾動(dòng)脈間接測(cè)壓法

頸動(dòng)脈直接測(cè)壓法不能滿足長(zhǎng)時(shí)間和反復(fù)多次的慢性實(shí)驗(yàn)，尾動(dòng)脈間接測(cè)壓法則可以克服這個(gè)難題。通過實(shí)驗(yàn)大鼠尾部或肢體動(dòng)脈處裝備壓脈套，連接可以檢測(cè)出動(dòng)脈收縮壓和舒張壓的檢測(cè)器，可直接測(cè)定血壓值。

隨著研究的深入，該方法得到進(jìn)一步優(yōu)化，Daugherty等開發(fā)了多通道高通量血壓計(jì)，可同時(shí)測(cè)量多達(dá)8只小鼠或大鼠的血壓，通過體積壓力記錄儀測(cè)定鼠尾收縮壓、舒張壓、心率、平均血壓、尾血流量和尾血容量，可以獲得更準(zhǔn)確的血壓參數(shù)，彌補(bǔ)原方法上的不足。

尾動(dòng)脈間接測(cè)壓法不會(huì)對(duì)動(dòng)物造成損傷，動(dòng)物在無麻醉狀態(tài)下測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)，避免了麻醉和應(yīng)激反應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，并且可以連續(xù)長(zhǎng)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)；但血壓值為間接獲得，靈敏度低，血壓若急劇變化可能檢測(cè)不到，因此不適用于血壓變化反應(yīng)靈敏的藥物實(shí)驗(yàn)。

2.4 植入式遙感監(jiān)測(cè)系統(tǒng)

植入式遙感監(jiān)測(cè)系統(tǒng)是在動(dòng)脈中植入傳感器，通過傳感器裝置直接測(cè)量動(dòng)脈血壓的技術(shù)，目前用于動(dòng)物研究的血壓感應(yīng)裝置有生理鹽水填充導(dǎo)管、傳感器導(dǎo)管、血壓遙測(cè)系統(tǒng)等，這些裝置可遠(yuǎn)程監(jiān)測(cè)血壓變化量，與尾動(dòng)脈間接測(cè)壓法一樣都是在動(dòng)物有意識(shí)的情況下測(cè)定血壓變化。

梁月琴等對(duì)比了尾動(dòng)脈間接測(cè)壓法和植入式遙感監(jiān)測(cè)大鼠血壓的差別，前者具有操作簡(jiǎn)便且適用范圍廣的優(yōu)點(diǎn)，但動(dòng)物生理狀況及環(huán)境因素對(duì)結(jié)果有較大影響，難以精確測(cè)量及動(dòng)態(tài)觀察血壓，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性較低；后者遙測(cè)系統(tǒng)設(shè)備昂貴，大部分實(shí)驗(yàn)室不具備相適應(yīng)的硬件，但是能夠檢測(cè)出更詳盡的數(shù)據(jù)供參考，例如監(jiān)測(cè)動(dòng)物的即時(shí)血壓情況等，動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)更能反映真實(shí)的藥理作用。

植入式遙感監(jiān)測(cè)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)在于實(shí)時(shí)獲取準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，能夠捕獲血壓的快速變化；缺點(diǎn)在于傳感器植入動(dòng)物的手術(shù)難度高，為防止手術(shù)部位感染，對(duì)手術(shù)環(huán)境及術(shù)后護(hù)理要求很高，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)周期變長(zhǎng)。

3 生物胺類物質(zhì)的理化測(cè)定方法

藥理學(xué)測(cè)定方法雖能從整體角度評(píng)估生物胺類物質(zhì)的藥理學(xué)效應(yīng)，但由于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)存在實(shí)驗(yàn)對(duì)象穩(wěn)定性難以保證，實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求高、過程復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)等問題，且無法明確不良反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此有必要建立靈敏、高效、快速的生物胺檢測(cè)方法，為生物胺類物質(zhì)的快速篩查，生成過程監(jiān)測(cè)及與不良反應(yīng)相關(guān)性的探究提供技術(shù)手段。

由于生物胺是一類可見及紫外光吸收度低、化合物極性大的小分子化合物，藥品中少量生物胺的測(cè)定容易受多種因素干擾，難以進(jìn)行直接檢測(cè)，因此，常采用提取效率高、消除基質(zhì)干擾的前處理方法，通過對(duì)少量的分析物富集從而提高信號(hào)強(qiáng)度，再配合快速便捷、靈敏度高的分析方法進(jìn)行定量測(cè)定。本文對(duì)目前生物胺含量測(cè)定的前處理方法和儀器分析方法進(jìn)行總結(jié)。

3.1 樣品前處理方法

3.1.1 固相萃取（SPE） SPE是以固相物作為萃取劑將目標(biāo)化合物從樣品中吸附出來，從而使目標(biāo)物與基質(zhì)分離，再通過洗脫劑使得目標(biāo)物與固相萃取劑分離，最終獲得富集的目標(biāo)物。王芳等建立了SPE結(jié)合氣相色譜法測(cè)定腌肉中5種生物胺，在選擇固相萃取柱時(shí)，比較了強(qiáng)陽離子交換柱（SCX）、強(qiáng)陰離子交換柱、C固相萃取柱的萃取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCX固相柱萃取生物胺萃取效果好，有較高的回收率，樣品前處理步驟簡(jiǎn)單，靈敏度高，結(jié)果重現(xiàn)性好。鄭捷等以固相萃取作為前處理，與高效液相色譜法聯(lián)用檢測(cè)了羊肉風(fēng)干腸中的6種生物胺，對(duì)比液液萃取和固相萃取，發(fā)現(xiàn)固相萃取更適用于樣品前處理，回收率更高，符合生物胺簡(jiǎn)便高效的檢測(cè)要求。

3.1.2 基質(zhì)固相分散萃取（MSPD） MSPD適用于固體、半固體的前處理，該方法樣品與有機(jī)物使用量少、萃取劑及目標(biāo)物接觸面積大。MSPD雖與SPE的填料相似，但分離原理不同，MSPD主要是根據(jù)目標(biāo)物在基質(zhì)中的分散情況與溶劑的極性不同分離目標(biāo)物，其中樣品基質(zhì)、洗脫劑與萃取劑是MSPD的重要影響因素。Calbiani等比較了SPE和MSPD兩種技術(shù)，SPE法使用了兩種固定相的固相萃取柱，分別為C和-CN，結(jié)果表明，以-CN為固定相的SPE法和MSPD法凈化效果良好，生物胺與雜質(zhì)分離效果顯著，回收率相當(dāng)，MSPD技術(shù)優(yōu)勢(shì)在于耗時(shí)更短，還可用于黏性樣品（生物組織等）的前處理。

3.1.3 液液萃取與液相微萃取 液液萃取根據(jù)物質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)不同的原理，將目標(biāo)物從一相轉(zhuǎn)移到另一相而達(dá)到分離。成本低是液液萃取的優(yōu)勢(shì)，但由于萃取液用量大，處理廢液是液液萃取需要解決的難題之一，萃取過程中費(fèi)時(shí)費(fèi)力，損耗樣品，回收率和重復(fù)性不盡如人意，常規(guī)的液液萃取在生物胺檢測(cè)過程中不作為首選考慮。Ramos等利用鹽析輔助液液萃取制備樣品，鹽析可以將水與水混溶的有機(jī)溶劑分離，有益于有機(jī)化合物與無機(jī)化合物的萃取，保證了高回收率。相比常規(guī)的液液萃取程序，鹽析輔助液液萃取溶劑消耗少，操作步驟簡(jiǎn)易，能夠有效避免目標(biāo)物的流失，實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵因素是萃取前pH與提取時(shí)間的準(zhǔn)確控制。

液相微萃取的提出彌補(bǔ)了液液萃取的不足之處，該方法采用微量溶劑置于溶液中，實(shí)現(xiàn)對(duì)于目標(biāo)物的微萃取，萃取過程中采用一次性纖維膜，可避免交叉污染，達(dá)到高度凈化樣品的效果。韋彩云等利用超聲輔助分散液相微萃取分離生物胺，優(yōu)化萃取和分析條件，用于檢測(cè)米酒中生物胺的含量，該方法萃取使用有機(jī)溶劑較少，回收率良好。

3.1.4 離子對(duì)萃取 離子對(duì)萃取是在適宜的pH條件下，生物胺與其帶相反電荷的離子對(duì)試劑反應(yīng)生成疏水性離子對(duì)，極性變小，進(jìn)入有機(jī)相，經(jīng)反萃取將生物胺陽離子釋放到酸性溶液中。采用離子對(duì)萃取與液質(zhì)聯(lián)用法，Chatzimitakos等等通過使用離子對(duì)試劑將生物胺萃取到有機(jī)溶劑中，然后進(jìn)行反萃取獲得NMR光譜，定量不同基質(zhì)樣品中生物胺的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性良好。Ochi等定量測(cè)定了鯖魚片中的生物胺，采用離子對(duì)固相萃取純化樣品，無需衍生化和pH調(diào)節(jié)，通過C色譜柱分離直接檢測(cè)8種生物胺，方法經(jīng)過驗(yàn)證顯示出良好的準(zhǔn)確性。

3.2 儀器分析方法

由于生物胺類物質(zhì)是強(qiáng)極性化合物，使用常規(guī)色譜柱分析時(shí)無法有效保留且分離能力差，同時(shí)部分生物胺不具備紫外或者熒光發(fā)色基團(tuán)，使用紫外檢測(cè)器或熒光檢測(cè)器無法檢測(cè)，因此，直接使用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)生物胺進(jìn)行檢測(cè)的難度較大，需要通過衍生化試劑處理后進(jìn)行測(cè)定。目前文獻(xiàn)中常見的衍生化試劑有丹磺酰氯、鄰苯二甲醛等，本文按照衍生化方法反應(yīng)原理、實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)樣品、優(yōu)勢(shì)及不足對(duì)研究進(jìn)行分類，見表2。這些衍生化方法適用的化合物范圍不同，每種方法都有其相對(duì)的優(yōu)勢(shì)和不足，實(shí)際應(yīng)用中需根據(jù)目標(biāo)物特性評(píng)估最佳衍生化策略。

表2 常見衍生化試劑及其實(shí)驗(yàn)方法
Tab 2 Common derivatization reagents and experiment methods

衍生化試劑 衍生化原理 檢測(cè)方法 反應(yīng)pH反應(yīng)時(shí)間/min 樣品基質(zhì) 優(yōu)勢(shì) 不足丹磺酰氯[41-42]（DNS-Cl）DNS-Cl可與伯胺和仲胺上的活潑氫反應(yīng)，與生物胺的氨基反應(yīng)生成熒光產(chǎn)物L(fēng)C-MS/MS、HPLC-UV弱堿性30～60補(bǔ)氣中藥材、黃連提取物國標(biāo)規(guī)定可使用的衍生化試劑，可降低生物胺極性，穩(wěn)定性高，應(yīng)用廣泛操作過程耗時(shí)耗力鄰苯二甲醛[40，42]（OPA）OPA在還原劑巰基乙醇存在下與生物胺迅速反應(yīng)產(chǎn)生具有很強(qiáng)熒光的異吲哚衍生物L(fēng)C-MS/MS、HPLC弱堿性1～2 發(fā)酵酒、黃連提取物是一種通用的熒光試劑，衍生化反應(yīng)過程時(shí)間短衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定性低芴甲氧羰酰氯（Fmoc-Cl）[42]Fmoc-Cl對(duì)堿性比較敏感，與生物胺的氨基反應(yīng)生成熒光產(chǎn)物L(fēng)C-MS/MS 酸性 60 黃連提取物 酸性條件下具有一定優(yōu)勢(shì) 衍生化過程中副反應(yīng)較多，易產(chǎn)生干擾物質(zhì)4-二甲胺偶氮苯磺酰氯[42]（Dabsyl-Cl）Dabsyl-Cl與生物胺的氨基反應(yīng)生成穩(wěn)定的熒光產(chǎn)物L(fēng)C-MS/MS 弱堿性60 黃連提取物 反應(yīng)過程操作簡(jiǎn)單 衍生化反應(yīng)不穩(wěn)定，產(chǎn)物隨反應(yīng)物比例的變化會(huì)不同Marfey試劑[42] 與手性分子中的氨基發(fā)生取代反應(yīng)，衍生化得到含兩個(gè)或以上手性中心的光學(xué)異構(gòu)體LC-MS/MS 弱堿性60 黃連提取物 適用于分離對(duì)映異構(gòu)體 衍生化效果通常不理想

樣品經(jīng)衍生化后使用HPLC檢測(cè)分析，雖然可以通過降低生物胺極性改善色譜分離情況，提高檢測(cè)的靈敏度，但存在衍生化過程復(fù)雜、衍生化反應(yīng)可產(chǎn)生未知雜質(zhì)等缺點(diǎn)而影響生物胺檢測(cè)的準(zhǔn)確性，表3列舉了目前成功應(yīng)用于生物胺檢測(cè)的6種檢測(cè)方法。多種方法聯(lián)用為生物胺的檢測(cè)提供了選擇和參考，但實(shí)際應(yīng)用中某一種方法并非適合所有樣品，需根據(jù)實(shí)際待測(cè)樣品選擇適宜的組合進(jìn)行生物胺類物質(zhì)檢測(cè)。

表3 聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)在生物胺測(cè)定中的應(yīng)用
Tab 3 Application of joined detection technology in the determination of biogenic amines

檢測(cè)方法 預(yù)處理方法 分析條件 檢測(cè)時(shí)間/ min 生物胺種類 檢測(cè)范圍（r2） 優(yōu)勢(shì)UHPLCFLD[43]經(jīng)丹磺酰氯衍生化后過濾進(jìn)樣分析流動(dòng)相A為0.01 mol·L－1甲酸銨溶液，B為乙腈，梯度洗脫，F(xiàn)LD激發(fā)波長(zhǎng)330 nm，發(fā)射波長(zhǎng)520 nm 18 色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺0.06～0.59 μg·mL－1（0.984～ 0.999）使用粒徑更小的色譜柱，配合耐高壓的色譜儀，大大減少分析時(shí)間，高效便捷，是分離復(fù)雜基質(zhì)中生物胺的理想選擇[44]HPLC-MS/MS[45-46]經(jīng)苯甲酰氯衍生化后過濾進(jìn)樣分析流動(dòng)相A為水，B為乙腈（0.1%甲酸），梯度洗脫，以同位素標(biāo)記為內(nèi)標(biāo)48 酪胺、色胺、組胺、苯乙胺、尸胺、腐胺、乙醇胺、精胺、亞精胺、β-丙氨酸、甲基丙基胺、3-甲基丁胺、2-甲基丁胺、3-（甲基硫）丙胺檢測(cè)限0.05 μg·kg－1可以避免常規(guī)色譜技術(shù)的主要缺點(diǎn)，對(duì)色譜無法準(zhǔn)確分離的生物胺進(jìn)行定量，具有廣泛的分析物相容性和高分析性能，是目前直接檢測(cè)生物胺普遍的選擇[47-48]超純水稀釋后過濾，進(jìn)樣分析流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，B為甲醇，梯度洗脫4.1 組胺、5-羥色胺、多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素0.5～1000 ng·mL－1（＞0.998）SFC-DAD[49]經(jīng)丹磺酰氯衍生化后過濾進(jìn)樣分析流動(dòng)相A為CO2，B為正己烷-異丙醇-氫氧化銨（70∶30∶15，V/V/V），梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，背壓2000 psi 7 苯乙胺、酪胺、色胺、精胺、尸胺、腐胺、組胺、亞精胺72～224 ng·mL－1（0.9995～1.0000）采用超臨界流體作為流動(dòng)相，介質(zhì)黏度小，傳質(zhì)速率高，結(jié)合液相色譜的硬件設(shè)施和控制軟件，更好地控制檢測(cè)過程的穩(wěn)定性，縮短了分析時(shí)間，消耗的溶劑更少，可作為液相色譜法檢測(cè)生物胺的一種補(bǔ)充方法GC-MS[50] 經(jīng)IBCF衍生化后用聚丙烯酸酯SPME纖維萃取，直接進(jìn)樣分析GC進(jìn)樣口溫度250℃，載氣為氦氣，程序升溫25 甲胺、二甲胺、丙胺、丁胺、異丁胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、酪胺、組胺0.1～1 μg·mL－1（0.991～ 0.999）可供選擇的固定相較多，不同的生物胺揮發(fā)性存在差異，經(jīng)衍生化后可選擇兼容多種生物胺衍生化物的固定相進(jìn)行分離，具有分析時(shí)間短、分離效果好靈敏度高的特點(diǎn)CE-MS[50] 將樣品超聲過濾后進(jìn)樣分析在毛細(xì)管中進(jìn)行分離生物胺，電解質(zhì)為 100 mmol·L－1甲酸，分離電壓30 kV 15 精胺、亞精胺、腐胺、組胺、尸胺、乙醇胺、三乙胺、苯乙胺、酪胺0.075～2.500 μg·mL－1（＞0.99）樣品無需衍生化，預(yù)處理方法更便捷CE-UV[51] 經(jīng)三次液液萃取后，氮?dú)獯蹈桑瑥?fù)溶進(jìn)樣分析在毛細(xì)管中進(jìn)行分離生物胺，電解質(zhì)為12 mmol·L－1 Im和 10 mmol·L－1 α-CD，分離電壓15 kV，檢測(cè)波長(zhǎng)200 nm 10 苯乙胺、組胺、色胺、5-羥色胺、章魚胺、多巴胺、去甲基腎上腺素、腎上腺素、肌肽、腐胺、尸胺、精胺、亞精胺1～150 μmol·L－1通過樣品離子與背景離子UV 性質(zhì)的差異，能同時(shí)檢測(cè)脂肪族芳香族和雜環(huán)族生物胺。適合組分簡(jiǎn)單和基質(zhì)純凈度高的樣品及熱不穩(wěn)定性的分析物[52]

4 結(jié)論與展望

復(fù)雜基質(zhì)藥物如中藥、抗菌藥物、生化藥物等原料取自動(dòng)植物體機(jī)體、組織或體液，來源復(fù)雜、提取物不明確、穩(wěn)定性差、易腐敗，部分藥物產(chǎn)生涉及微生物發(fā)酵或動(dòng)物源性原料貯存，游離氨基酸均極易通過脫羧反應(yīng)降解為生物胺，且其種類較多，故建立高效簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法用于生物胺類物質(zhì)的定性定量測(cè)定是有效控制生物胺含量的前提。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究生物胺種類、濃度與不良反應(yīng)的相關(guān)性，明確各生物胺類物質(zhì)劑量-效應(yīng)關(guān)系變化，可以為臨床不良反應(yīng)的分析控制提供科學(xué)的參考數(shù)據(jù)。因此，根據(jù)樣品類型與所測(cè)生物胺的特點(diǎn)選取適宜的前處理與檢測(cè)方法進(jìn)行系統(tǒng)研究，并結(jié)合臨床應(yīng)用探究各種生物胺類物質(zhì)的不良反應(yīng)發(fā)生的可能性，進(jìn)一步明確原料及制劑工藝及存在條件的影響和質(zhì)控要求，可以為藥物的安全性評(píng)估、風(fēng)險(xiǎn)因素排查分析、臨床安全用藥提供支持和保障。