脊髓背角miR-16-5p可能通過靶向Akt3調節帶狀皰疹后遺神經痛

張德新，張桂友

(遵義醫科大學附屬醫院疼痛科，貴州 遵義 563000)

帶狀皰疹后遺神經痛(PHN)是帶狀皰疹(HZ)最常見的后遺癥，HZ愈合后超過1個月仍存在原皮損區疼痛，則為PHN[1]。中國醫院內統計顯示，HZ的發病率為7.7%，PHN的發病率為2.3%，其中29.8%的HZ患者會發展為PHN[2]。目前尚缺乏良好的PHN治療藥物及方法，其中原因之一為PHN的疼痛機制尚未闡明[3]。

MiRNA是具有調控功能的非編碼RNA，主要通過與靶基因結合，抑制后者的功能。因其生物學效應顯著、分子量小(22 nt左右)、易于合成和改良，具有很好的臨床應用前景。神經病理性疼痛動物模型能誘導背根神經節、脊髓背角、海馬及前扣帶皮層中的miRNA出現差異性表達，miRNA在NP中的作用機制可能涉及神經炎性反應、突觸可塑性、神經元興奮性和DNA甲基化[4]。MiRNA作為一種微型介質，有可能成為神經病理性疼痛的生物學標志物及可能潛在的治療靶點，從而為神經病理性疼痛提供更好的診斷和治療方法[5]。可見miRNA參與了神經病理性疼痛的發生發展。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 雄性SPF級C57/BL6J小鼠24只，體重25～30 g，鼠齡6～8周，購于長沙天勤生物技術有限公司，證書編號：SCXK(湘)2014-0011。飼養于貴州省麻醉與器官保護重點實驗室動物房。

1.1.2主要試劑 BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天，上海)；CIP buffer(Exiqon，丹麥)；CIP酶(Exiqon，丹麥)；DEPC水(Solarbio，北京)；HRP標記羊抗兔二抗(博士德，武漢)；HRP標記羊抗小鼠二抗(博士德，武漢)；Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit(Clontech，美國)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara，日本)；RNAiso Plus(Takara，日本)；樹脂毒素(RTX，Acros，美國)；RIPA裂解液(碧云天，上海)；TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus,Takara，日本)；TEMED(國藥集團，上海)；兔多抗Akt3一抗(ab152157,Abcam，英國)；三氯甲烷(氯仿,川東化工，重慶)；吐溫-80(Solarbio，北京)；無水乙醇(川東化工，重慶)；小鼠單抗β-actin一抗(博士德，武漢)；異丙醇(富宇，天津)。

1.1.3主要儀器 -80 ℃低溫冰箱(Thermo Fisher，美國)；ATY224電子分析天平(亞萊博，杭州)；ChemiDocTM MP成像系統(Bio-Rad，美國)；Milli-Q Integral超純水系統(Millipore，美國)；NanoDrop ND-1000分光光度計(Thermo Fisher，美國)；聚合酶鏈反應(PCR)儀(Bio-Rad，美國)；Plantar Test儀(IITC，美國)；von Frey纖維絲(Danmic，美國)；垂直電泳儀(Bio-Rad，美國)；低溫高速離心機(Thermo Fisher，美國)；多功能酶標儀(Thermo Fisher，美國)；濕轉轉膜儀(Bio-Rad，美國)。

1.2方法

1.2.1PHN小鼠建模及痛閾測定 將小鼠分為PHN組和Vehicle組，每組12只，PHN組腹腔注射10 μg/kg RTX構建PHN小鼠模型，建模成功后小鼠可出現同PHN患者類似的熱痛覺減退(熱痛閾升高)和機械痛覺超敏(機械痛閾降低)[6-8]。Vehicle組注射等量的RTX溶劑(10%乙醇、10%吐溫-80與生理鹽水混合溶液)。在RTX和Vehicle注射前及注射后第 4、7、14、21、28天，通過測定PHN小鼠足底熱痛閾、機械痛閾確認建模成功。

熱痛閾測定：熱痛閾通過檢測熱縮足潛伏期(TWL)采用Hargreaves熱輻射法測定。保持室溫18～20 ℃，將小鼠分別放在罩有有機玻璃外殼的透明玻璃表面上適應環境30 min。適應環境30 min后，使用足底輻射熱痛覺測試儀(Plantar Test儀，IITC公司)，將熱輻射光源直接放置在左后爪的正下方后，激活設備，記錄小鼠縮足、甩腿、舔足等動作的時間，超過30 s后仍未縮足、甩腿、舔足，記錄儀器自動停止時間記為30 s，每只測試3次，每次測量間隔5 min，3次測量的平均值為TWL。

機械痛閾測定：機械痛閾通過檢測機械退縮閾值(MWT)，采用von Frey纖維絲測痛套件(Damic，美國)，由小到大依次使用不同力度的von Frey纖維絲由下往上垂直刺激小鼠足底皮膚，逐漸加大力度至合適刺激強度[9-10]，觀察后足回縮反應(或舔足、甩腿等)時的刺激強度，在5次測量中，至少有3次出現縮足反應，測量結束，每次測量間隔5 min，3次測量的平均值為MWT。

1.2.2脊髓背角取材 在建模前及建模后的第14天分別取PHN組與Vehicle組小鼠脊髓背角。首先用七氟烷對小鼠進行麻醉，待充分麻醉后取俯臥位，暴露T11～L3段脊柱，用脊髓適配器固定小鼠脊柱。沿脊髓走形剖開小鼠皮膚及皮下組織，咬骨鉗輔助暴露T13～L1脊柱下的脊髓(即脊髓腰膨大部分，脊髓L3～L5節段)，再取膨大處背側脊髓，-80 ℃凍存直至使用。

1.2.3PCR檢測miR-16-5p、Akt3表達 使用RNAiso Plus(Takara，日本)提取總RNA。采用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit(Clontech，美國)和PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara，日本)進行RNA的反轉錄。用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Takara，日本)對RNA進行擴增。使用2-ΔΔCt計算相對表達量。引物見表1。

1.2.4Western blotting檢測Akt3表達 加200 μL裂解液裂(含2 μL苯甲基磺酰氟、2 μL磷酸酶抑制劑)，置于自動勻漿機中勻漿，將離心管置于冰上30 min充分裂解。30 min后，將裂解液移至1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心力4 ℃離心5 min，取蛋白上清。樣品稀釋20倍，用 BCA 法測定蛋白濃度。每孔加入40 μg蛋白進行電泳，將蛋白轉移到 PVDF 膜上； PVDF膜用含5%脫脂奶粉TBST(封閉液)浸泡，室溫搖床封閉2 h。用封閉液稀釋相應一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4 ℃過夜。TBST充分洗滌5次，每次5 min。用TBST稀釋相應二抗(1∶5 000稀釋)，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37 ℃搖床孵育2 h。TBST洗滌5次，每次5 min。將電化學發光法(ECL)試劑中增強液與穩定的過氧化物酶溶液按1∶1比例混合，反應約2 min，將PVDF膜平放在曝光板上，將混合均勻的顯影液覆蓋在PVDF膜的正面充分反應，依照發光的強度選擇不同的曝光時間。

2 結 果

2.1PHN小鼠模型的建立 PHN組小鼠在第14天開始出現穩定的熱痛閾升高和機械痛閾的下降，Vehicle組小鼠痛閾未見變化。見圖1。

2.22組脊髓背角miR-16-5p、Akt3表達情況比較 與Vehicle組比較，在建模后的第14天，PHN組miR-16-5p表達下調，Akt3表達上調；進一步用western blotting檢測Akt3蛋白的表達，與Vehicle組比較，在建模后的第14天，PHN組Akt3蛋白表達上調。見圖2。

3 討 論

本研究通過RTX腹腔注射構建PHN小鼠模型，并分別在建模后第14天取脊髓背角組織。PCR檢測發現，miR-16-5p在建模后第14天下調，進一步檢測miR-16-5p的靶基因Akt3，發現Akt3的mRNA及蛋白表達均上調。已有多項研究報道，Akt3是miR-16-5p的靶基因[11-13]。進一步推論miR-16-5p可能通過靶向作用于Akt3，從而在PHN疼痛的發生發展中發揮重要作用。

MiRNA是具有調控功能的非編碼RNA，通過轉錄后調控神經病理性疼痛的病理過程[14-15]。MiRNA在慢性疼痛患者和健康對照之間存在顯著差異，這些異常表達的miRNA與炎癥調節、傷害性信號傳遞及蛋白激酶功能相關[16]。BAI等[17]在2007年首次報道了炎性疼痛模型中miRNA的異常表達，在疼痛大鼠的三叉神經節中，miR-10a、miR-29a、miR-98、miR-99a、miR-124a、miR-134和miR-183的表達下調。HUANG等[18]檢測HZ和PHN患者血清miRNA的表達譜差異發現，有5個miRNA可能參與了HZ向PHN轉化過程。QIU等[19]通過分析PHN模型大鼠同側背根神經節的基因表達GSE64345數據組，并通過基因本體對差異基因進行分析，分別發現了11、31個與神經病理性疼痛和炎癥相關的miRNA。ZOU等[20]通過大鼠腹腔注射RTX構建PHN模型，并給予電針處理，發現電針通過增加miR-223-3p的表達抑制PHN中的神經元細胞自噬。

既往已有miR-16-5p可能參與疼痛調節的報道[21-23]。TANG等[21]通過生物信息分析發現在保留性神經損傷的神經病理性疼痛動物模型的背根神經節中，有80個差異表達的基因，并預測miR-16-5p可能參與了神經病理性疼痛發生、發展，有望成為神經病理性疼痛診斷和治療的靶點。CCI大鼠模型的脊髓背角中miR-16表達上調，通過鞘內注射抑制劑使其表達下調，可以顯著減輕CCI大鼠的熱痛和機械痛覺過敏[22]。在CFA誘導的炎癥性疼痛大鼠模型的脊髓背角中，miR-16表達水平降低，RAB23表達水平明顯升高，通過鞘內注射miR-16可緩解疼痛，提高痛閾值，注射RAB23后加重疼痛；螢光素酶報告基因實驗證實，RAB23是miR-16的直接靶基因，提示miR-16通過靶向RAB23和抑制P38 MAPK的激活來緩解慢性炎癥性疼痛[23]。本課題組在臨床上收集了5例PHN患者雙側皮膚，通過miRNA芯片篩查發現，與健康側皮膚比較PHN患者疼痛側皮膚中差異miRNA共317個，其中有67個在PHN組上調，250個下調。從芯片篩選出的差異miRNA中選取19個行PCR驗證，結果顯示miR-16-5p和其他5個miRNA的表達趨勢和芯片結果相同[24]。以上研究提示，miR-16-5p可能參與PHN疼痛的發生、發展。

Akt是一種絲/蘇氨酸激酶，又名蛋白激酶B，其是磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)下游的重要靶點，通過磷酸化、調控凋亡蛋白和轉錄因子介導PI3K通路的關鍵功能[25-26]。已有多項研究提示，Akt參與疼痛調節[27-30]。ZHANG等[27]發現，隱丹參酮通過抑制PI3K/Akt通路中Akt的磷酸化減輕CCI術后神經痛。在脊神經結扎和CCI大鼠背根神經節和脊髓背角中Akt活性增加，p-Akt增加，給予PI3K或Akt抑制劑后，可減輕模型的神經病理性疼痛[28-29]。有學者總結了PI3K/Akt通路的激活促進坐骨神經損傷、糖尿病周圍神經病變、脊髓損傷、骨癌、阿片類藥物引起的痛覺過敏等慢性疼痛的進展及維持[30]。

以上Akt與疼痛關系的研究，均是在總蛋白水平，既往關于Akt各亞型與疼痛的報道很少。近幾年已有Akt3參與疼痛調節的研究。PASKU等[31]在腰椎間盤突出患者中分析3種Akt亞型的表達模式，發現Akt1和Akt3存在顯著的正相關，在腰椎間盤突出中具有協同作用；在急性疼痛患者中Akt2表達上調，提示Akt2可能與急性炎癥和吞噬相關。近年來在CCI大鼠模型中發現，miR-15a、miR-20b-5p、miR-150、miR-145表達明顯降低，并預測Akt3為靶基因，通過過表達miR-15a、miR-20b-5p、miR-150、miR-145，靶向使Akt3表達下調，使CCI大鼠熱痛和機械痛覺過敏緩解，提示Akt3可能參與了CCI大鼠疼痛的發生、發展[32-35]。

本研究考慮miR-16-5p的靶基因為Akt3，且已有多項研究報道Akt3是miR-16-5p的靶基因[11-13]。例如，在乳腺癌患者中發現miR-16-5p低表達，且miR-16-5p低表達的乳腺癌患者生存率低于高表達miR-16-5p患者；螢光素酶報告實驗證實Akt3為miR-16-5p的靶基因，miR-16-5p通過抑制核因子-κB(NF-κB)通路和靶向作用于Akt3，抑制乳腺癌的發展[11]。在胃癌患者和胃癌細胞系中，環狀RNA circNF1可與miR-16結合，螢光素酶報告實驗顯示miR-16抑制Akt3表達[12]。口腔鱗癌患者和細胞系中，miR-16表達下調，螢光素酶報告實驗證實miR-16通過靶向作用于Akt3抑制腫瘤細胞的增殖，誘導細胞的凋亡[13]。

以上研究均提示miR-16-5p可以通過靶向作用于Akt3發揮生物學功能，但目前還沒有miR-16-5p靶向作用于Akt3調節疼痛的相關研究。盡管如此，已有研究提示miR-15a、miR-20b-5p、miR-150、miR-145等可靶向作用于Akt3參與調控CCI大鼠疼痛的發生、發展[32-35]。本研究也間接證明了miR-16-5p可能通過靶向作用于Akt3參與調控PHN疼痛的發生、發展。