結直腸癌組織中DCAF7、miR-98-3p表達和意義

金一鳴, 高 娜, 門學千, 向國卿

(遼寧省腫瘤醫院 內鏡科, 遼寧 沈陽, 110042)

結直腸癌(CRC)是最普遍的惡性腫瘤之一，主要影響患者胃腸道，尤其是結腸、直腸和盲腸[1]。飲食習慣、炎癥反應、DNA改變、遺傳多態性、基因-環境相互作用和微生物群組成的變化等被認為是CRC發展的潛在危險因素[2]。盡管診斷和治療技術不斷改進，但許多CRC患者的臨床結果和預后仍然較差[3]。此外，可用于準確預測早期CRC的可靠標志物較少，使其診斷和治療具有一定難度[4]。微小RNA(miRNAs)是一類長度約為22個核苷酸的小型非編碼單鏈RNA, 在腫瘤的發生、轉移中發揮重要作用。miRNA表達的改變與包括CRC在內的各種癌癥之間有密切關系[5], 故miRNA可能對CRC患者具有重要的診斷和預后價值。研究[6]表明, miR-98-3p在肺癌、肝癌等多種腫瘤組織和細胞中呈低表達，并在腫瘤細胞增殖和侵襲過程中發揮負性調控作用。miR-98在結腸癌患者的癌組織中低表達，與腫瘤惡性程度呈負相關[7]。DNA損傷結合蛋白1和CUL4相關因子(DCAF)家族可通過對其靶蛋白進行泛素化修飾，實現對細胞生長、分化、凋亡等生命活動的調控。其中, DCAF7是DCAF家族蛋白的主要成員之一, DCAF7主要參與調控細胞增殖分化[8], 但目前關于DCAF7在結直腸癌中表達的研究較少。因此，本研究通過檢測結直腸癌組織中DCAF7、miR-98-3p的表達情況，探討二者在結直腸癌組織中的作用及與臨床病理特征的相關性，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年6月—2018年6月遼寧省腫瘤醫院收治的結直腸癌患者70例為研究對象，收集其術中切除的結直腸癌組織及癌旁正常組織。70例患者中男32例，女38例，年齡30～52歲，平均(37.50±1.40)歲。納入標準: ① 經影像學檢查、病理檢查確診為結直腸癌的患者; ② 首發腫瘤者; ③ 病理資料完整者。排除標準: ① 嚴重心、肝、腎疾病，以及感染性疾病、其他惡性腫瘤患者; ② 術前接受過放療、化療及生物治療者。本研究所有患者及家屬均被告知，并獲得患者的知情同意。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)法檢測組織中miR-98-3p水平: 使用TRIzol試劑(Invitrogen，美國)提取組織中總RNA，使用分光光度計(NanoDrop Technologies，美國)對RNA進行定量，并進行逆轉錄得到cDNA(逆轉錄反應程序為16 ℃ 30 min, 42 ℃ 42 min, 85 ℃ 5 min)。該cDNA作為RNA擴增的模板，采用qRT-PCR法對miR-98-3p進行擴增(qRT-PCR反應程序為94 ℃ 5 min, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 20 s, 共設40個循環), miR-98-3p以U6作為內參，使用2-△△Ct方法對mRNA水平進行定量分析。miR-98-3p及內參引物序列見表1。miR-98-3p以患者的腫瘤組織相對表達水平中位數為臨界值，超過該范圍則判定為高表達。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.2 免疫組織化學染色觀察組織中DCAF7蛋白表達: 所有手術切除標本的石蠟包埋塊被切成4 μm厚的切片，并安裝在載玻片上。切片使用二甲苯脫蠟并在酒精中脫水。將組織切片與0.3%過氧化氫孵育10 min以阻斷內源性過氧化物酶活性。然后進行抗原修復，組織切片在微波爐中10 mmol/L檸檬酸緩沖液中煮沸10 min后，用10%正常兔血清緩沖液孵育20 min以阻斷非特異性結合位點。檸檬酸修復抗原后，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每次3 min, 加入一抗(DCAF7兔多克隆抗體)4 ℃孵育過夜。PBS沖洗，加入二抗37 ℃孵育15 min, 進行DAB染色以及蘇木精復染后脫水、透明、封片。根據切片的染色強度以及陽性細胞百分比進行評分: 0分為無陽性細胞; ≤25%的陽性細胞為1分; >25%～50%陽性細胞為2分, >50%陽性細胞為3分。染色強度: 無染色為0分，淺黃色為1分，黃褐色為2分，深褐色為3分。綜合計分為以上2種評分相加, ≤3分判定為陰性, >3分判定為陽性。

1.2.3 Western blot法檢測DCAF7蛋白水平: 用RIPA裂解緩沖液(Pierce, 美國)裂解組織樣本，然后收集裂解液，用BCA蛋白檢測試劑盒(碧云天生物科技有限公司，中國)定量。使用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質后，轉移到聚偏二氟乙烯膜上。膜在室溫下在3%脫脂奶粉中封閉30 min, 隨后與一抗DCAF7(1∶1 000, Sigma-Aldrich, 美國)和GAPDH(1∶5 000, Proteintech, 中國)4 ℃孵育過夜，洗膜緩沖液(TBST)清洗10 min, 然后加入辣根過氧化物酶(HRP)偶聯的二抗(1∶10 000, 蘇州賽維斯生物科技有限公司，中國)室溫1 h。檢測使用ECL蛋白質印跡檢測試劑(美國密理博)進行，將印跡的特定蛋白質表達水平標準化為GAPDH。Image J軟件用于分析條帶密度。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 結直腸癌組織及癌旁組織中DCAF7蛋白的表達情況

結直腸癌組織中DCAF7蛋白的陽性表達率為71.43%(50/70), 癌旁組織中陽性表達率為8.57%(6/70), 差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1、表2。

A: 結直腸癌組織; B: 癌旁組織。

表2 結直腸癌組織及癌旁組織中DCAF7蛋白陽性表達情況

2.2 結直腸癌組織及癌旁組織中DCAF7蛋白水平

結直腸癌患者癌組織中DCAF7蛋白的表達水平為(0.61±0.11), 高于癌旁組織的(0.19±0.02), 差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 結直腸癌組織及癌旁組織中miR-98-3p水平比較

結直腸癌組織中miR-98-3p表達水平為(1.93±0.34), 低于癌旁組織的(3.67±0.71), 差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4 結直腸癌患者癌組織中DCAF7、miR-98-3p表達的相關性

分析結果顯示，結直腸癌患者癌組織中DCAF7、miR-98-3p表達呈負相關，差異有統計學意義(r=-0.376,P<0.05)。見圖3。

2.5 DCAF7蛋白和miR-98-3p表達與結直腸癌患者臨床病理參數的關系

結果顯示，結直腸癌患者癌組織中DCAF7蛋白的表達與患者性別、年齡以及腫瘤直徑、腫瘤位置、浸潤程度無關(P>0.05), 與淋巴結轉移、TNM分期和分化程度有關(P<0.05); miR-98-3p表達與患者的性別、年齡、浸潤程度以及腫瘤位置無關(P>0.05), 與TNM分期、淋巴結轉移、腫瘤直徑和分化程度有關(P<0.05)。見表3。

2.6 結直腸癌組織中DCAF7蛋白和miR-98-3p

水平對結直腸癌的診斷價值

ROC曲線顯示，外周血DCAF7蛋白和miR-98-3p含量評估結直腸癌的曲線下面積(AUC)分別為0.864(95%CI: 0.796～0.916)、0.835(95%CI: 0.763～0.892), 對應的敏感度分別為82.86%、90.00%, 特異度分別為78.57%、68.57%。二者聯合評估結直腸癌的AUC為0.952(95%CI: 0.902～0.981), 敏感度為97.14%, 特異度為77.14%。見圖4。

表3 結直腸癌組織中DCAF7蛋白、miR-98-3p的表達與臨床病理參數的關系

3 討 論

CRC是全球第三大最常見的癌癥類型[9]。結直腸癌的發生發展與生活方式、遺傳因素、結直腸腺瘤密切相關。該病的病因與個體基因突變有關，包括不同類型的染色體突變和DNA錯配修復[10]。近年來，新的治療方法和診斷技術的開發和應用，顯著降低了CRC的病死率。然而, CRC的發病機制尚不完全清楚。

miRNA在細胞分化、增殖、凋亡等過程中發揮重要作用，其異常表達與腫瘤的發生發展有密切關系[11]。研究[12-14]表明, CRC中miR-143和miR-145表達顯著下調，提示miRNA可能成為CRC治療中潛在的基因治療靶點。研究[15]表明, miR-98在多種腫瘤中呈低表達，與口腔鱗狀細胞癌、結腸癌、卵巢癌和肺癌等的轉移有關，例如miR-98通過靶向一型胰島素樣生長因子受體(IGF1R)表達來抑制口腔鱗狀細胞癌的增殖和轉移。此外, miR-98通過下調整合素B3(ITGB3)抑制非小細胞肺癌的增殖、遷移和侵襲。miR-98-3p是miR-98家族重要成員，在本研究中，結直腸癌組織中miR-98-3p水平低于癌旁組織，結直腸癌患者癌組織中miR-98-3p表達水平與患者年齡、性別、腫瘤位置和浸潤程度無關，與TNM分期、分化程度、腫瘤直徑以及淋巴結轉移有關。上述結果提示miR-98-3p與結直腸癌的惡性程度相關，并參與結腸癌的發生發展進程。

DCAF蛋白家族是機體維持正常生長發育的重要蛋白質家族，參與細胞增殖分化、凋亡等一系列調控，該家族已累計發現60種蛋白，其蛋白過表達或缺失與臨床許多腫瘤、發育障礙等的發生發展關系密切，為腫瘤的臨床治療提供更多方向[7]。磷酸化調節激酶1A(DYRK1A)是調節細胞增殖和分化之間平衡的一個重要激酶。研究[16]發現, DCAF7與DYRK1A互相作用，參與維持其穩定性。但目前關于DCAF7在結腸癌中的研究較少。本研究中，結直腸癌組織中DCAF7蛋白水平顯著高于癌旁組織，結直腸癌組織中DCAF7蛋白陽性表達率為71.43%, 癌旁組織中DCAF7陽性表達率為8.57%; 結直腸癌患者癌組織中DCAF7蛋白表達與患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤直徑和浸潤程度無相關性，與TNM分期、淋巴結轉移以及分化程度有相關性，提示DCAF7蛋白也與結直腸癌的惡性程度相關。研究進一步發現，結直腸癌組織中DCAF7與miR-98-3p表達水平呈明顯負相關，推測二者之間存在某種負調控關系，共同參與結直腸癌的發生發展。ROC曲線顯示，外周血DCAF7蛋白和miR-98-3p含量評估結直腸癌的AUC分別為0.864、0.835, 對應的敏感度分別為82.86%、90.00%, 特異度分別為78.57%、68.57%。二者聯合評估結直腸癌的AUC為0.952, 敏感度為97.14%, 特異度為77.14%。這表明DCAF7與miR-98-3p有望成為結直腸癌診斷的潛在指標。

綜上所述, DCAF7在結直腸癌組織中高表達, miR-98-3p呈低表達，二者呈負相關，可作為判斷結直腸癌患者病情發展的潛在生物指標，二者的表達可對患者臨床病理特征進行一定的判斷分析，但二者在結直腸癌患者中的確切機制有待進一步研究。