葡萄白粉病菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測體系的建立與應(yīng)用*

王雯雯，劉心緣，馬云妮，顧沛雯

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021）

葡萄白粉病是由葡萄鉤絲殼菌（Uncinula necator）引起的一種真菌性病害，主要侵染葡萄的葉片、新梢、果實等部位[1]。幼葉受害后，病斑初期呈半透明狀，逐步發(fā)展后葉片正面覆蓋有灰白色的粉狀物，嚴重時白粉可布滿葉片正反兩面，并迅速蔓延至嫩莖、果粒和果梗，造成大量裂果，葉片黃化脫落，減產(chǎn)嚴重[2]。葡萄白粉病的發(fā)生和流行需要高溫悶熱的天氣條件，當氣溫為20～27 ℃、空氣相對濕度為40%～85%時最適宜分生孢子的萌發(fā)和傳播，病害一旦發(fā)生，會迅速侵染周圍健康葉片，田間蔓延速度極快[3]。葡萄白粉病菌是一種活體營養(yǎng)專性寄生菌，無法人工培養(yǎng)，這在一定程度上影響了對該菌的早期診斷、監(jiān)測和遺傳多樣性等方面的深入研究。目前對于葡萄白粉病菌的早期診斷和檢測，主要采用傳統(tǒng)的單孢子分離和保濕培養(yǎng)的方法[4]，但是該方法費時費力且缺乏準確性，難以滿足對越冬和潛伏期菌源的監(jiān)測需要。因此，在生產(chǎn)中急需一種實用、操作簡便且快速準確的葡萄白粉病菌檢測方法。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是由Notomi 等于2000 年研發(fā)的一種新型核酸擴增方法[5]。該方法針對目的基因序列的特異性區(qū)域設(shè)計不同的內(nèi)外引物，在具有鏈置換活性的DNA 聚合酶催化作用下，能夠形成大小不一的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和多環(huán)花椰菜結(jié)構(gòu)的DNA 片段混合物。該方法具有反應(yīng)時間短、特異性強、靈敏度高、易于操作的特點，被廣泛應(yīng)用于植物病原真菌、細菌和病毒等病原的檢測[6-7]。Kong等[8]實現(xiàn)了葡萄霜霉病菌（Plasmopara viticola）的LAMP 快速檢測，為確定葡萄霜霉病防控適期提供指導(dǎo)。黃雯等[9]建立的茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）LAMP檢測方法，實現(xiàn)了田間快速檢測。趙媛媛等[10]建立了玉米莖腐病的強雄腐霉（Pythium arrhenomanes）LAMP 體系，在60 min 內(nèi)即可快速、準確地獲得檢測結(jié)果，能夠滿足現(xiàn)場快速檢測的要求。

本研究根據(jù)GenBank 中葡萄白粉病菌（U.necator）的細胞色素P450 全長基因序列設(shè)計3 組LAMP 引物，通過優(yōu)化反應(yīng)條件及體系，檢測方法的特異性、靈敏性以及實用性，構(gòu)建葡萄白粉病菌LAMP 檢測技術(shù)體系，旨在為葡萄白粉病菌的早期診斷和預(yù)測預(yù)報提供一種切實可行的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

11 種葡萄及其他作物病原菌（表1）經(jīng)過單孢子分離，接種于健康寄主植物繁育后，通過形態(tài)學(xué)觀察和rDNA-ITS 序列分析進行菌株鑒定，-80 ℃保存于寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理實驗室。

表1 供試菌株

1.2 儀器與試劑

所用儀器：Simpli Nano 超微量分光光度計（GE Healthcare 公司，美國），T 100TM Thermal Cycler PCR儀（Bio Rad 公司，美國），Azure c200 凝膠成像系統(tǒng)（Azure Biosystems 公司，美國），Blook 藍光透照儀（Genedirex 臺灣德怡科技有限公司），Sigma 3K 15 通用臺式冷凍離心機（Sigma 公司，美國）。

所用試劑：真菌DNA 提取試劑盒（Biospin?Fungus Genomic DNA Extraction Kit，BioFlux 公司，日本），植物DNA 提取試劑盒（E.Z.N.A.?HP Plant DNA Mini Kit，Omega Bio-tek 公司，美國），Bst DNA polymerase（New England Biolabs 公司，美國），甜菜堿（Sigma Aldrich 公司，美國），dNTP Mixture（BBI 生命科學(xué)有限公司），Taq PCR Master Mix［生工生物工程（上海）股份有限公司］，SYBR Green I（上海瑞楚生物科技有限公司），2 000 bp DNA Marker（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank 中葡萄白粉病菌細胞色素P450基因序列（登錄號：EF649777.1），運用Primer explorer V4（http://primerexplorer.jp/）在線設(shè)計LAMP引物，參照LAMP 引物設(shè)計原則，通過引物自由能、引物長度以及GC 含量等篩選獲得3 組LAMP 引物（表2），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 LAMP 引物序列

1.4 LAMP 引物篩選及特異性檢測

使用Biospin?Fungus Genomic DNA Extraction Kit 提取菌絲DNA。用E.Z.N.A.?HP Plant DNA MiniKit 提取葡萄葉片總DNA。用Simpli Nano 超微量分光光度計檢測DNA 濃度及OD值，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

依據(jù)Kong等[8]的方法建立LAMP 反應(yīng)體系，并且進行調(diào)整：DNA 模板1 μL，10×Thermopol Buffer 2.5 μL，50 μmol/L FIP/BIP 0.7 μL，20 μmol/L F3/B3 0.25 μL，10 mmol/L dNTPs 2.5 μL，5 mol/L 甜菜堿5 μL，10 mmol/L MgCl26 μL，8 U/μL bst DNA polymerase 1 μL，ddH2O 補足至25 μL。反應(yīng)條件為：65 ℃恒溫擴增75 min。利用上述反應(yīng)體系以葡萄白粉病菌DNA 為模板，對合成的3 對引物進行LAMP 擴增篩選。反應(yīng)結(jié)果通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，或加入SYBR Green I 熒光染液，在自然光下和藍光儀下觀察顏色變化（陽性為綠色且有熒光，陰性為橙色且無熒光）。

使用篩選出的引物對上述（表1）提取的11 種病原真菌DNA 進行LAMP 擴增，以ddH2O 為空白對照，檢測引物的特異性。

1.5 LAMP 反應(yīng)體系的優(yōu)化

依據(jù)1.4 的LAMP 檢測方法，對反應(yīng)條件進行優(yōu)化。分別檢測反應(yīng)時間（30～120 min）、反應(yīng)溫度（50～70 ℃）、Bst DNA 聚合酶濃度（0.192～0.512 U/μL）、甜菜堿濃度（0～1.6 mol/L）、dNTPs 濃度（0～3.0 mmol/L）、Mg2+濃度（0～8.0 mmol/L）和內(nèi)外引物配比（1∶1～10∶1）對LAMP 的影響。

1.6 LAMP 反應(yīng)體系靈敏度檢測

將葡萄白粉病菌的DNA 基因組經(jīng)超微量分光光度計測定濃度后按10 倍稀釋，對應(yīng)的濃度分別為100 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL 和10 fg/μL，分別以各稀釋梯度的DNA 溶液為模板，以ddH2O 為空白對照，進行LAMP 和常規(guī)PCR 檢測，比較二者的檢測靈敏度差異。

常規(guī)PCR 以葡萄白粉病菌細胞色素P450 全長基因序列為檢測靶標，引物序列為Uc592+5′-AGTT AAAAGATGTCAACGCCGAAGA-3′、Uc946-5′-AGC GGCAAAAGATGAGTCAAAATTC-3′[11]。PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 補足體系至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 田間葡萄白粉病樣品檢測

2021 年8 月1 日在寧夏立蘭酒莊、蒲尚酒莊、新牛酒莊和玉泉營苗木繁育基地4 個葡萄園采集共40 份葡萄白粉病病葉，在寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院采集10 份葡萄無菌組培苗葉片，以ddH2O 為空白對照，無菌組培苗葉片為陰性對照，按照1.4 的方法提取葡萄葉片總DNA，使用優(yōu)化后的LAMP 反應(yīng)體系進行擴增。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

如圖1 所示，只有引物UN-LAMP-1 能夠擴增出明顯的梯狀條帶，其他引物均無條帶出現(xiàn)。加入SYBR Green I 熒光染液后，引物UN-LAMP-1 反應(yīng)液為綠色，在藍光儀下呈現(xiàn)出熒光；其他反應(yīng)液為橙色，在藍光儀下無熒光出現(xiàn)（圖版2-A、B）。

圖1 引物篩選

2.2 特異性檢測

如圖2 所示，只有葡萄白粉病菌DNA 擴增出梯狀條帶，其他菌種DNA 和對照均未出現(xiàn)條帶。加入SYBR Green I 熒光染液后，葡萄白粉病菌DNA 反應(yīng)液為綠色，在藍光儀下呈現(xiàn)出熒光；其他菌種DNA以及對照的反應(yīng)液均為橙色，在藍光儀下無熒光出現(xiàn)（圖版2-C、D）。說明該引物特異性較好。

圖2 引物特異性檢測

2.3 LAMP 反應(yīng)體系的優(yōu)化

2.3.1 反應(yīng)時間

如圖3 所示，當反應(yīng)時間為45 min 時開始出現(xiàn)條帶但亮度較淺，當反應(yīng)時間為60、75 min 時條帶最亮且最清晰，當反應(yīng)時間為90、105、120 min 時條帶雖然較亮但清晰度較差。加入SYBR Green I 熒光染液后，當反應(yīng)時間為60、75 min 時反應(yīng)液為綠色且熒光較強，反應(yīng)時間為90、105、120 min 時次之，反應(yīng)時間為45 min時反應(yīng)液為綠色但熒光較暗，反應(yīng)時間為30 min 時反應(yīng)液為橙色且無熒光（圖版2-E、F）。為節(jié)約時間，選擇60 min 作為后續(xù)試驗的反應(yīng)時間。

圖3 反應(yīng)時間對LAMP 的影響

2.3.2 反應(yīng)溫度

如圖4 所示，當反應(yīng)溫度為50～70 ℃時均可擴增出梯狀條帶，隨著溫度的升高梯狀條帶亮度先升高后下降，在65.9 ℃時條帶最亮。加入SYBR Green I 熒光染液后，在藍光儀下均可見熒光，當反應(yīng)溫度為50.0～62.0 ℃時，反應(yīng)液為綠色且熒光隨溫度的增加而增強；當反應(yīng)溫度在65.9～70.0 ℃時，反應(yīng)液為綠色且熒光隨溫度的增加而變暗（圖版2-G、H）。因此，選擇62.0 ℃為LAMP 的最佳反應(yīng)溫度。

圖4 反應(yīng)溫度對LAMP 的影響

2.3.3 DNA 聚合酶濃度

如圖5 所示，Bst DNA 聚合酶在終濃度變化為0.256～0.512 U/μL 濃度梯度下均出現(xiàn)條帶，在濃度為0.256 U/μL 時出現(xiàn)梯狀條帶但較淺，當濃度為0.320 U/μL時梯狀條帶最清晰，在0.384～0.512 U/μL時隨著濃度的增加條帶亮度減弱。加入SYBR Green I 熒光染液后，當Bst DNA 聚合酶濃度在0.320～0.512 U/μL時，反應(yīng)液為綠色且熒光較強；在0.192～0.320 U/μL時，反應(yīng)液由橙色逐漸轉(zhuǎn)為綠色且熒光隨著Bst DNA 聚合酶濃度的增加而增強（圖版2-I、J）。因此，反應(yīng)體系中Bst DNA 聚合酶的最佳濃度為0.320 U/μL。

圖5 Bst DNA 聚合酶濃度對LAMP 的影響

2.3.4 甜菜堿濃度

如圖6 所示，當甜菜堿在終濃度為0～1.6 mol/L濃度梯度下均有梯狀條帶出現(xiàn)，但當終濃度為0 時條帶極淺，當終濃度為0.8 mol/L 時梯狀條帶最明亮且清晰。加入SYBR Green I 熒光染液后，當終濃度在0～0.4 mol/L時，反應(yīng)液由橙色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色且熒光逐漸增強；在0.4～1.6 mol/L時，反應(yīng)液均為綠色且熒光較強、差異較小（圖版2-K、L），因此，選取終濃度為0.8 mol/L 的甜菜堿為反應(yīng)體系的最佳含量。

圖6 甜菜堿濃度對LAMP 的影響

2.3.5 dNTPs 濃度

如圖7 所示，當dNTPs 的終濃度為0 時無梯狀條帶出現(xiàn)，隨著dNTPs 濃度的升高，梯狀條帶亮度與清晰度均逐漸增加，在2.6 mmol/L 時達到最亮、最清晰。加入SYBR Green I 熒光染液后，隨著dNTPs濃度的升高，反應(yīng)液由橙色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色且熒光逐漸增強；在1.6～3.0 mmol/L時，反應(yīng)液均為綠色且熒光較強、差異較小（圖版2-M、N）。因此，選取終濃度為2.6 mmol/L 的dNTPs 為反應(yīng)體系的最佳含量。

圖7 dNTPs 濃度對LAMP 的影響

2.3.6 Mg2+濃度

如圖8 所示，當Mg2+終濃度在0～8.0 mmol/L時均有梯狀條帶出現(xiàn)，當終濃度為4.8 mmol/L時，條帶最亮且最清晰。加入SYBR Green I 熒光染液后，當Mg2+終濃度在0～1.6 mmol/L時，反應(yīng)液由橙色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色且熒光隨著終濃度的增加而逐漸增強；當Mg2+終濃度在2.4～8.0 mmol/L時，反應(yīng)液均為綠色且熒光較強、差異較小（圖版2-O、P）。因此，選取終濃度為4.8 mmol/L 的Mg2+為反應(yīng)體系的最佳含量。

圖8 Mg2+濃度對LAMP 的影響

2.3.7 內(nèi)外引物配比

如圖9 所示，當內(nèi)外引物比例在2∶1～10∶1時均有梯狀條帶出現(xiàn)，在比例為6∶1 時條帶最亮且最清晰。加入SYBR Green I 熒光染液后，當比例在1∶1～3∶1時，反應(yīng)液為橙色且熒光亮度均較暗；當比例在3∶1～10∶1時，反應(yīng)液均為綠色且熒光較強、差異較小（圖版2-Q、R）。因此，選擇6∶1 為LAMP 的最佳內(nèi)外引物配比。

圖9 內(nèi)外引物配比對LAMP 的影響

2.4 靈敏度檢測

利用優(yōu)化后的LAMP 體系和常規(guī)PCR 對10 倍濃度梯度稀釋的基因組DNA 進行擴增，如圖10 所示，常規(guī)PCR 方法的檢測靈敏度為10 pg/μL；而優(yōu)化后的LAMP 體系的檢測靈敏度為1 pg/μL（圖11，圖版2-S、T），靈敏度是常規(guī)PCR 的10 倍。

圖10 常規(guī)PCR 靈敏度檢測

圖11 LAMP 靈敏度檢測

2.5 田間葡萄白粉病的LAMP 檢測

從寧夏立蘭酒莊、蒲尚酒莊、新牛酒莊和玉泉營苗木繁育基地采集共40 份葡萄白粉病的病葉，在寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院采集10 份葡萄無菌組培苗葉片，提取葉片總DNA，應(yīng)用建立的LAMP 體系進行擴增，結(jié)果如表3、圖12 和圖版2-V、W 所示，優(yōu)化后的LAMP 體系能夠檢測出不同來源的葡萄白粉病病葉，準確率達100%。

表3 田間樣品檢測結(jié)果

圖12 LAMP 檢測田間葡萄白粉病（部分樣品）

3 討論與結(jié)論

預(yù)測預(yù)報技術(shù)是準確防控葡萄白粉病、減少農(nóng)藥使用和精準施用的關(guān)鍵。因此，開展葡萄白粉病預(yù)測預(yù)報研究，對于科學(xué)防治葡萄白粉病具有重要的意義[12]。分子檢測技術(shù)是作為預(yù)測預(yù)報的重要手段，可為精準的預(yù)測預(yù)報提供分子技術(shù)方案[13]。目前已成功建立了普通PCR 和熒光定量PCR 檢測葡萄白粉病的方法。Bouscaut等[14]利用葡萄白粉病菌CYP51基因設(shè)計了一對特異性引物TransA/RtransA，建立了葡萄白粉病菌常規(guī)PCR 檢測體系，并對田間采集的575 份不同地區(qū)的葡萄白粉病樣品進行檢測。顧沛雯等[15]利用葡萄白粉病菌ITS 基因序列設(shè)計了1 對特異性引物UNF2/UNR2，建立了實時熒光定量PCR 反應(yīng)體系，并對人工接種葡萄白粉病菌的潛伏期葉片內(nèi)病原菌DNA 進行real-time PCR 檢測。但常規(guī)PCR 和熒光定量PCR 都依賴于精密的儀器設(shè)備和昂貴的試劑，不僅檢測成本高，而且對檢測人員專業(yè)能力要求也較高，難以廣泛應(yīng)用于田間植物病原物的現(xiàn)場檢測[16]。而LAMP 檢測方法具有操作簡單、靈敏性強、準確率高等優(yōu)點，并且可在60 min 左右得到結(jié)果，大幅度縮短了檢測時間[7]。

目前，LAMP 檢測方法多數(shù)是以真菌通用ITS序列作為靶標，如Fukuta等[17]依據(jù)群結(jié)腐霉（Pythium myriotylum）的ITS 序列設(shè)計LAMP 特異性引物，能夠從水培樣品中檢測到P.myriotylum，顯示出與常規(guī)PCR 一致的敏感度；杜然等[18]以ITS 序列作為檢測靶標，建立了特異性的油菜黑脛病菌和莖基潰瘍病菌的LAMP 檢測方法，為高通量檢測油菜黑脛病菌和莖基潰瘍病菌奠定了基礎(chǔ)。但筆者前期根據(jù)葡萄白粉病菌ITS 序列設(shè)計的1 對內(nèi)引物和1 對外引物建立的葡萄白粉病菌LAMP 檢測體系，不僅能夠檢測到葡萄白粉病菌DNA 基因組，同樣也能夠檢測到瓜類等其他植物白粉病菌DNA 基因組，特異性較差。ITS 序列在不同物種間較保守，尤其在相近物種間序列差異更小，因此特異性不高是其缺陷[19]。本研究使用細胞色素P450 全長基因序列設(shè)計篩選出以UNITF3-1/UNITB3-1 為外引物，UNITFIP-1/UNITBIP-1 為內(nèi)引物，特異性較好，可用于建立葡萄白粉病菌LAMP 檢測體系。

本研究獲得了葡萄白粉病菌LAMP 最佳反應(yīng)條件：以UNITF3-1/UNITB3-1 為外引物、UNITFIP-1/UNITBIP-1 為內(nèi)引物，反應(yīng)體系中Bst DNA 聚合酶濃度為0.320 U/μL，甜菜堿濃度為0.8 mol/L，dNTPs濃度為2.6 mmol/L，Mg2+濃度為4.8 mmol/L，內(nèi)外引物配比為6∶1，在62 ℃反應(yīng)60 min，可最低檢測到1 pg/μL 的葡萄白粉病菌。所建立的體系適用于田間葡萄樣品的檢測，反應(yīng)穩(wěn)定且便于操作，若檢測時無PCR儀，能夠使用其他恒溫設(shè)備完成反應(yīng)過程[10]。在對擴增產(chǎn)物進行檢測時，除使用瓊脂糖凝膠電泳檢測的方法外，還可使用核酸染料染色來確定樣品是否感染葡萄白粉病菌。本研究所建立的葡萄白粉病菌LAMP 檢測體系特異性強，檢測時間短，能夠滿足各基層技術(shù)部門對于葡萄白粉病菌的快速檢測的需求，具有實用性和推廣價值。