基于耳石不同切面的小黃魚年齡鑒定及其生長方程年齡反演比較

康中杰，宋大德，李 綱，嚴利平，仲霞銘，湯建華，王燕平，吳 磊，熊 瑛

（1.上海海洋大學海洋科學學院，上海 201306；2.江蘇省海洋水產研究所，江蘇南通 226007；3.中國水產科學研究院東海水產研究所，農業農村部海洋與河口漁業重點開放實驗室，上海 200090）

耳石是由生物礦化作用所形成的碳酸鈣結晶，耳石上沉積物質顯示出每日積累，其在代謝上幾乎是惰性的，具有極好的保守性，因此可用來鑒定魚類的日齡和年齡［1］。對于硬骨魚類來說，相比其他硬組織（鱗片、脊椎骨、鰓蓋等），耳石仍然是最常用、最可靠的年齡鑒定的生物材料［2］。魚類的年齡與生長一直是魚類種群動力學參數估算的基礎，許多學者運用魚類耳石的不同切面做了年齡與生長方面的相關研究［3-4］；耳石也被應用于魚類生長參數估算，大多數生長參數估算方法都是以隨著年齡增長的體型增長理論為基礎，如最常用的Von Bertalanffy生長方程（VBGF）參數估算方法，那么基于耳石的生長模型估算不同時期魚類體型的變化為研究魚類生長提供了一個可行可靠的途徑［5］。然而，由于獲取耳石切片的相對較高的時間成本和年齡鑒定的難度，基于魚體體長或體質量指標利用已有的魚類生長方程來反推魚體年齡，成為當前年齡估算的一種便捷方法。

小 黃 魚［Larimichthys polyactis（Bleeker，1877）］屬石首魚科，黃魚屬，為暖溫性底層魚類，分布于我國東海、黃海和渤海以及朝鮮半島西岸海域［6］。小黃魚的資源狀況一直備受國內外學者的關注，是我國海洋經濟漁業資源研究的模式種，在我國海洋漁業資源中占有十分重要的地位［6］。隨著對小黃魚的開發利用，自20世紀90年代起小黃魚群體年齡結構簡單，呈現“低齡化”，多為1～3齡［7］，對這一定性結論的精細化研究卻較為少見，而根據近年體長組成特征，間接反映出小黃魚低齡化狀況有所緩解［8］。因此，對小黃魚年齡進行準確鑒定是研究小黃魚種群結構必不可少的一項基礎性工作。研究者們對石首魚科大黃魚（Larimichthys crocea）、小黃魚、白姑 魚（Pennahia argentata）、黃 姑 魚（Nibea albiflora）、棘頭梅童魚（Collichthys lucidus）等開展過年齡研究［9-10］。由于其耳石晶體結構層厚，無法從耳石表面來觀察年輪，常以分析單個切面進行年齡鑒定。針對小黃魚耳石磨片制作，蘭永倫和羅秉征［11］曾嘗試過從3個不同方向切割小黃魚耳石以確定最佳切片位置和方向，但并未對小黃魚耳石輪紋進行比對分析。此外，大部分學者以獲取的體長數據通過小黃魚的生長方程來反演年齡［12-14］，但其反演結果的準確性并未加以驗證。

本文以黃海南部小黃魚矢耳石為研究材料，基于矢耳石縱切面、橫切面、水平切面3個切面進行年齡鑒定［1，15］，比較3個切面判讀年輪的效果，同步系統地歸納我國近30年來小黃魚的生長方程以進行年齡反演，通過二者年齡鑒定結果的比對，總結小黃魚年齡鑒定和估算的關鍵點，提出魚類年齡研究的科學性、合理性的建議，以期為漁業資源管理積累基礎資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究隨機選取小黃魚樣本共計45尾，分別于2018年4月在黃海南部的呂四漁場（121°40＇E～121°50＇E、32°10＇N～32°20＇N）采集小黃魚15尾，于2019年9月在大沙漁場（122°40＇E～122°50＇E、33°40＇N～33°50＇N）采集小黃魚30尾。小黃魚樣品冷凍保存后運輸至實驗室進行生物學測定，主要測體長（standard length，SL）（精確至1mm）、體質量（body weight，BW）（精確至0.01g）等參數。用鑷子摘取矢耳石作為年齡鑒定材料，去除表面雜質，用酒精清洗、干燥后，編號保存在離心管中。其中，4、9月分別取5、10尾小黃魚的耳石用于縱切面、水平切面、橫切面切片分析（表1）。

表1 小黃魚耳石3個切面樣本資料Tab.1 Sampling details of L.polyactis in three sections（mean±SD）

1.2 耳石切片制作

根據小黃魚耳石切面示意圖（圖1）并參考熊瑛等［16］的方法制作耳石切片，但其中部分制作過程略有調整。首先，將A膠和B膠按照1∶1體積比涂在錫箔紙上用酒精燈微微加熱充分攪拌混合，點滴于鑲樣杯杯底，耳石按不同切面水平放于AB膠上30 min，待耳石固定后用環氧冷鑲嵌溶液［樹脂和硬化劑（質量比為1∶7），丹麥Struers公司］包埋，置于37℃烘箱中干燥12 h。然后，用DTQTM5低速精密切割機切去多余的樹脂，用熱熔膠將其固定于標準載玻片上研磨。研磨過程中先用P500的SiC砂紙粗磨至耳石核心即將暴露，再用P2000的SiC砂紙精磨至耳石核心，最后換用裝有MD-Chem拋光布的磨拋機（RotoPol-35，丹麥Struers公司）輔以0.25μm OP-S拋光液拋光。如此完成一面，將耳石切片另外一面重復上述操作步驟，直至核心完全暴露。

圖1 小黃魚耳石切面示意圖Fig.1 Schematic diagram of the otolith sections for L.polyactis

1.3 年齡讀取

本研究采用直接讀取和酸蝕后讀取輪紋兩種方式進行。將耳石切片置于5%的EDTA進行酸蝕［3］，每隔1 s取出，用去離子水清洗、拭干，并在反射光下和透射光下切換觀察，直至能在金相顯微鏡下獲得清晰年輪帶。

所有耳石切片制作好后在金相顯微鏡下觀察并拍照。由于耳石切面面積較大，拍攝單張照片無法顯示完整的耳石面，故先將耳石含輪紋的各部分拍成照片后，使用S-gauge軟件拼接出成完整輪紋照片，以分析年輪。

耳石年齡讀取，采用CAMPANA和NEILSON［17］的方法，在不清楚樣本大小、性別的情況下，每個耳石切片分別由三人讀取并記錄，取三人讀取結果的平均值納入后續的處理。參考PAUL和HORN［18］的方法，對小黃魚耳石3個切面年輪的清晰度按照等級進行評分：1）“非常好”（輪紋清晰，年輪直觀）；2）“一般”（輪紋較為清晰，經仔細確認后可以辨別）；3）“難以辨認”（輪紋模糊，年輪辨別困難）。

1.4 生長方程年齡反演

通過系統整理近30年來探究小黃魚年齡與生長的VBGF文獻，得出19個VBGF［12-14，19-33］（表2），用于對本文45尾小黃魚的年齡反演。Von Bertalanffy生長方程為：

表2 渤海、黃海、東海小黃魚Von Bertalanffy生長方程Tab.2 Von Bertalanffy grow th equation of L.polyactis in Bohai Sea（BS），Yellow Sea（YS），and East China Sea（ES）

式中，Lt表示生物體在t齡時的體長；L∞表示生物體的漸進體長，也稱極限體長或最大體長；t0表示理論上體長（Lt）等于零時的年齡，是一個假定的理論常數；K為生長曲線的平均曲率，表示趨近漸進值的相對速度。

采用單因素方差分析（ANOVA）對生長參數K和L∞進行統計檢驗，從而解釋不同生長方程參數的差異性。統計分析采用SPSS 23.0軟件，當P＜0.05時，認為差異顯著。

理論上，因取樣區域源自黃海南部，可假設其樣本歸屬于南黃海族種群，其產卵高峰期在每年的4月［7］，因此，默認本研究4月份采集的小黃魚年齡測記依次為1齡、2齡、……，9月份采集的小黃魚（5月齡≈0.417齡）年齡測記依次為1.417齡、2.417齡、……。

分別以3個耳石切面鑒定得出的年齡與不同生長方程得出年齡相比對，計算出方程與各切面比對的相似度，即表中年齡測記與生長方程計算結果相同（當年齡反演結果為1.00～1.99時，認為與1齡和1.417齡是相同；當年齡反演結果為2.00～2.99時，認為與2齡和2.417齡是相同）的個數在總數中所占比例，進而得出最吻合的生長方程，公式如下：

2 結果與分析

2.1 矢耳石3個切面特征

在金相顯微鏡下觀察，小黃魚耳石切片中心核呈圓形，核內深黑色的圓形結構為耳石原基。反射光下耳石切片上呈現明暗交替的環帶現象，明帶（不透明帶）與暗帶（半透明帶）之間是一種漸變的過渡。明暗交替的輪紋作為讀取年齡的標志，即一條明帶和暗帶共記作1齡。

2.1.1 縱切面

小黃魚耳石縱切面切片（圖2）形狀為不規則橢圓形，前端較寬，后端較窄。耳石核心靠近背端，在年輪排列區域，由耳石核心到邊緣年輪間距呈現有規律的縮短，靠近中心核的輪紋間距較大，靠近邊緣的輪紋間距顯著變窄。由耳石中心核到邊緣，輪紋由圓環狀逐漸變為橢圓狀。隨著輪紋的增加，輪紋逐漸呈現為無規律、不規則曲線狀，這一現象同樣出現于水平切面和橫切面上。縱切面在未酸蝕的情況下不易分辨年輪，較另外兩個切面具有更多的干擾輪紋，易使年輪讀取產生偏差，使鑒定結果偏大（圖2）。酸蝕之后，年輪帶相對明顯（圖3）。

2.1.2 水平切面

小黃魚耳石水平切面（圖2，圖3）核心至邊緣輪紋逐漸增多，輪紋形狀不規則。水平切面核心區域由輪紋密集而形成的最長軸，在進行年齡鑒定時，只觀察長軸上緣的年輪帶不足以準確鑒定年輪數量，需要借助長軸下緣年輪帶矯正，但少數切片的長軸下緣年輪不清晰，干擾輪紋較多，難以分辨，導致年齡鑒定效果不好。由于水平切面核心區域面積較小，在研磨時較難掌握切片厚度，導致在透射光下亮帶與暗帶較難區分且無法觀察到核心區域。因此，在觀察水平切面年輪時應盡量使用反射光觀察。水平切面酸蝕之后，年輪帶更為明顯。

2.1.3 橫切面

小黃魚耳石橫切面（圖2，圖3）在研磨過程中，不易磨至核心區域。當以橫切面為截面觀察年輪時，年輪暗帶和明帶分界清晰，較易觀察，在反射光下能清晰辨別出年輪帶，核心周圍區域幾乎沒有干擾輪紋，大多數切片無需酸蝕可觀察到年輪。橫切面切片由核心區域到邊緣的輪紋形狀由平滑的曲線變為不連續曲線或折線，輪紋寬度不一且波動較大。針對橫切面，建議盡量使用反射光邊研磨邊觀察年輪情況。酸蝕之后，年輪帶也更為明顯。

圖2 反射光下小黃魚耳石3個切面及年齡標記（未酸蝕）Fig.2 Age signs on three sections of otolith for L.polyactis under reflected light（no acid etching）

圖3 反射光下小黃魚耳石3個切面及年齡標記（酸蝕）Fig.3 Age signs on three sections of otolith for L.polyactis under reflected light（acid etch）

2.2 矢耳石3個切面清晰度評分比較

對小黃魚矢耳石3個切面輪紋清晰度評價結果（表3）顯示，橫切面輪紋的清晰度最高，被判斷為“非常好”的比例高達73.33%；其次是水平切面，被判斷為“非常好”的比例達66.67%；而縱切面被判斷為“一般”和“難以辨認”的比例近乎50.00%。

表3 小黃魚耳石3個切面的清晰度評分Tab.3 Distribution of readability scores for three otolith sections of L.polyactis

2.3 生長方程年齡反演與年齡鑒定比對

基于VBGF方程年齡反演結果詳見表4。用單因素方差分析法對渤海、黃海及東海海域的生長參數K、L∞進行差異分析，結果表明，K值差異性顯著（P＜0.05）、漸進體長L∞無顯著差異（P＞0.05）。將生長方程計算結果與年齡測記對比之后分別得出縱切面、水平切面、橫切面的相似度。在縱切面相似度中，生長方程Lt＝366［1-e-0.11777（t+1.76429）］和Lt＝230［1-e-0.26（t+0.3678）］反演結果的相似度比較高，分別為53.33%和66.67%。在水平切面相似度中，生長方程Lt＝206.827［1-e-0.45413（t+0.3534）］反演結果的相似度為66.67%，生長方程Lt＝366［1-e-0.11777（t+1.76429）］反演結果的相似度為86.67%，其他生長方程均在50.00%以下。在橫切面相似度中，生長方程Lt＝206.827［1-e-0.45413（t+0.3534）］反演結果的相似度 為80.00%，生 長 方 程Lt＝366［1-e-0.11777（t+1.76429）］反演結果的相似度為86.67%。由于生長方程Lt＝206.827［1-e-0.45413（t+0.3534）］的研究中采用的樣本數僅100尾，可能會因樣本量較少而導致本實驗中年齡反演結果不準確，故排除。Lt＝230［1-e-0.26（t+0.3678）］反演結果的水平切面和橫切面的相似度較低，也可排除。由此得出，黃海及東海小黃魚的生長方程Lt＝366［1-e-0.11777（t+1.76429）］的年齡反演結果，與本實驗中小黃魚年齡最吻合。結合清晰度評分，故可排除縱切面作為小黃魚的年齡鑒定最佳切面。

表4 小黃魚生長方程年齡反演結果與不同切面年齡相似度對照表Tab.4 Sim ilarity com paring table of age backward inferring results of grow th equations w ith age determ ination from three otolith sections for L.polyactis

3 討論

3.1 3個切片特征比較

年齡鑒定在漁業資源評估、漁業管理和資源的合理開發中具有重要作用，高估或低估年齡都可能會造成資源的過度開發或浪費，而魚類耳石年輪的清晰度會影響魚類年齡鑒定的準確性。本文對耳石不同切面清晰度評分中顯示，橫切面的清晰度最高，年齡鑒定效果最好。分析其原因為，橫切面較其他切面表面積較小，易觀察，同時受次生核影響較小，在研磨過程中即使切片過薄也不易導致年輪帶不清晰。

耳石切片上的年輪表現為明暗交替的環帶現 象，這 與 丁 城 志 等［34］在 描 述 孔 吻 鲃（Poropuntius huangchuchieni）耳石年輪特征時一致。耳石年輪的形成是由于環境因素和魚類內源機制的共同作用［17，35-36］。春夏季節魚類攝食活動旺盛，生長速率快，碳酸鈣堆積在耳石的量增多，耳石形成半透明帶，秋冬季節由于光照減弱導致水溫低，攝食活動和生長速率有所降低，碳酸鈣堆積速度變慢，耳石形成不透明帶［1］。切片輪紋由核心區域至邊緣的變化對應到具體的耳石形態變化過程為，從小黃魚矢耳石早期的圓形到后期的近橢圓形且表面有不規則疣狀突起，原因可能是與小黃魚幼魚到成魚的生長發育有關［37］。這種變化也出現在多數魚類上，如姜濤等［3］發現刀鱭（Coilia nasus）矢耳石從早期的圓形變化至后期前端分叉的紡錘形，嚴太明等［38］發現骨唇黃河魚（Chuanchia labiosa）矢耳石由早期的圓形發育為后期的箭矢狀。

縱切面切片表面積較大，這有利于運用耳石微化學最大化地反映小黃魚全生活史［39-40］。縱切面切片核心周圍區域干擾輪紋較多，會對小黃魚幼魚日輪的判斷產生影響。干擾輪紋的產生可能是由于次生核的影響，而次生核形成原因與仔魚向稚魚的變態發育有關，仔魚期生長率快的個體，其次生核數量可能越多［41］。耳石的輪紋特征不僅可以反映個體發育過程以及棲息環境變化等狀況［42］，還可以用于鑒別不同地理群系小黃魚［43-44］，這種方法已見于對大西洋鯡（Clupea harengus）等魚類的研究［45］。

在研磨過程中，水平切面的年輪帶較易觀察，在不酸蝕的情況下大多數耳石也能觀察到年輪（圖2），因此適宜做年齡鑒定。水平切面也可以用來研究小黃魚耳石微結構從而判斷日齡和生長狀況［9］。水平切面靠近核心區域的輪紋部分密集，其最長軸更有利于耳石微化學分析。

橫切面適宜作為年齡鑒定的最佳切面。這與姜濤等［3］和劉子俊等［4］在研究刀鱭和次南極電燈魚（Electrona carlsbergi）的結論一致。小黃魚橫切面幾乎無次生核，也可觀察仔、稚魚日齡并進行生長分析。胡海生等［10］在制作小黃魚橫切面切片時將耳石橫切為厚度0.5 mm的薄片，這種方法較易磨至耳石核心區域，但要掌握好耳石切割位置。

3.2 生長方程年齡反演

本研究中生長方程的年齡反演以水柏年［32］研究最具代表性，其方程反演的年齡與樣本小黃魚3個切面鑒定的年齡相似度均最高。其可能原因分析如下：首先，水柏年［32］實驗樣本包括黃海、東海海域的小黃魚，其樣本的區域性與本研究樣本區域是基本重疊的，這可能是其相似度較高的原因之一。其次，水柏年［32］采用一元線性回歸方法擬合的生長方程預測準確率較高；鑒于目前小黃魚種群結構單一的現狀仍未改變，如果使用Ford-Walford生長變換法會導致生長參數科學性不高［12］，這一論點在嚴利平等［33］研究中有所證實。嚴利平等［33］認為，使用逆算體長以Ford-Walford生長變換法和非線性回歸方法兩種方法來擬合生長方程，結果表明非線性回歸方法較Ford-Walford生長變換法有較好的擬合。第三，水柏年［32］實驗中生長指標不僅包括魚體長和純重，而且以耳石作為擬合生長方程的年齡鑒定材料，這也是其方程相似度較高的重要原因。此外，本研究中也出現了一些研究者的方程反演結果與鑒定結果偏離較大的情況。如LIU等［22］生長方程反演年齡較其他結果偏大，其原因可能是在計算t0時只是將其代入PAULY［46］的經典公式而并未進行修正，由此產生較大誤差；不同區域小黃魚的生長發育狀況不同或是本身屬于不同的種群，這也可能是導致其生長方程反演年齡與年齡鑒定相似度較低的原因之一。需要指出的是，許多魚類的生長方程擬合僅采用體長或體質量頻率分布法，如本研究中所涉及的小黃魚生長方程利用耳石、鱗片等年齡材料做輔助擬合的研究較少，而單一方法擬合得出的生長方程準確性也還有待驗證；同時，擬合生長方程時，可考慮運用多種方法、多重比較，進而選擇更優的擬合方法。因此，在以魚體體長或體質量作為參數推斷魚類年齡時不能簡單地選擇生長方程進行反演，不僅要考慮取樣時間、海域等差異性，還應結合魚類年齡印證結果和生長方程擬合方法擇優選擇。

同樣，年齡反演結果還受制于該生長方程模擬時的樣本選取。在取樣時，樣本量并非越多越好，關鍵在于個體大小范圍，成體和幼體均應有一定數量。但由于樣本數量的要求以及采樣可能導致魚類死亡等問題，這些生長數據的獲取所需要的時間成本是不容忽視的，生長方程是基于各類體型范圍的個體大小的數據進行擬合以得到最優的生長方程參數擬合結果［5］。對于小黃魚而言，雌性個體往往比雄性個體稍大［8］，應盡量將雌、雄魚分別計算生長方程，以此來避免雌雄魚體長和體質量的不同所導致的誤差。在本次取樣中有體長為100 mm以下的雌性小黃魚已達到性成熟，而所有生長方程反演年齡不滿1齡，由此驗證了水柏年［32］提出的小黃魚性成熟提前的現象，同時也間接說明生長方程反演結果無法覆蓋特殊個體。年齡反演作為魚類年齡鑒定和生長研究中重要的研究手段，在反映生物資源量及種群結構動態變化上有著極其重要的意義，基于小黃魚的年齡反演研究還有待繼續開展。

此外，年齡鑒定材料和方法在研究魚類年齡和年齡反演中也尤為重要。就同一種魚而言，不同的年齡鑒定材料上的年輪的清晰程度和數目不一定是相同的，且不同年齡段的魚的年齡鑒定最適材料也可能是不一樣的［47］。目前小黃魚年齡鑒定材料中，耳石是應用最廣泛的材料，鱗片也可作為年齡材料，金顯仕［19］借助鱗片作為輔助擬合生長方程。另外，脊椎骨還被應用在大眼金槍魚（Thunnus obesus）和大黃魚的年齡鑒定上［47-48］。不同的魚類其理想的鑒定材料也不同，所以在條件許可時往往需要通過多種材料進行鑒定并比較其優劣。劉艷超等［49］研究雙須葉須魚（Ptychobarbus dipogon）利用微耳石、星耳石、脊椎骨、鰓蓋骨、臀鱗、胸鱗、側線鱗和背鱗等8種年齡材料分析比較，從而選擇最適材料。小黃魚不同年齡段的年齡鑒定最適材料還有待進一步研究，作為除耳石和鱗片之外的補充材料，為以后小黃魚的年齡鑒定提供參考依據。關于年齡鑒定，年輪檢視常是最有效的方法［50］之一。但這種方法也存在主觀性等缺點，盡管有學者認為邊際增量分析是對年齡鑒定的極好補充［2］，但是這種方法的適用性和精確性等還有待證實。

耳石被廣泛用于研究魚類的種群結構和生長特征［51-52］，年齡鑒定的可靠性至關重要。盡管小黃魚資源小型化、低齡化的問題有所改善，但其種群結構簡單化的問題依然嚴峻。因此，有必要加強小黃魚年齡鑒定的基礎性研究和種群動力學科研攻關，確保我國小黃魚漁業資源的可持續利用。