歐洲鰻鱺RIG-I基因的克隆、序列特征分析與原核表達(dá)

李英英，陳 曦，楊金先，陳 強(qiáng)，宋鐵英，葛均青

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，福州 350003；2.福建省養(yǎng)殖動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與新型飼料企業(yè)工程技術(shù)研究中心，福州 350003）

維甲酸基因I（retinoic acid-inducible gene I，RIG-I）與黑色素瘤分化相關(guān)基因5（melanoma differentiation-associated gene 5，MDA5）、實(shí)驗(yàn)遺傳和生理基因2（laboratory of genetics and physiology 2，LGP2）都屬于RIG-I樣受體（RIG-I like receptors，RLRs），是DExD／H box RNA解旋酶家族的成員［1］，可識(shí)別病原微生物表面的病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs），與下游接頭分子結(jié)合，產(chǎn)生信號(hào)級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，激活宿主的天然免疫信號(hào)通路，誘導(dǎo)干擾素（IFN）和促炎因子等抗病毒效應(yīng)分子的表達(dá)［2-3］。RIG-I和MDA5的結(jié)構(gòu)和功能類似，N端都有兩個(gè)串聯(lián)的半胱天冬酶富集結(jié)構(gòu)域（CARD），是病毒RNA的胞質(zhì)傳感器，在病毒入侵時(shí)識(shí)別病毒mRNA并啟動(dòng)RIG-I樣受體與其特定的配體結(jié)合，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IFN和炎癥因子，抵御病毒侵襲［4］；LGP2的N端缺少CARD結(jié)構(gòu)域，不能傳遞病毒識(shí)別信號(hào)，但其對(duì)RLR信號(hào)通路有調(diào)控作用［5-8］。盡管RIG-I和MDA5的結(jié)構(gòu)和功能都類似，但RIG-I偏向于識(shí)別短鏈dsRNA和5＇PPP dsRNA［9］，未被dsRNA刺激時(shí)處于自抑制狀態(tài)［10］；而MDA5偏向于識(shí)別長(zhǎng)鏈dsRNA，未發(fā)現(xiàn)其存在自我抑制的狀態(tài)［11］。RIG-I既可識(shí)別RNA病毒，也可識(shí)別DNA病毒；而MDA5僅可識(shí)別RNA病毒［12］。因此，在DNA病毒侵染宿主的過程中，RIG-I及其介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在宿主抗病毒免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。

鰻鱺屬（Anguilla）魚類是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)魚類，其產(chǎn)值在水產(chǎn)品出口貿(mào)易中占有重要地位。隨著集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，鰻鱺養(yǎng)殖期間病害頻發(fā)，給業(yè)者造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙行業(yè)的健康發(fā)展。鰻鱺“脫黏敗血綜合征”是養(yǎng)殖鰻鱺幼鰻期高發(fā)的傳染性疫病，病鰻主要出現(xiàn)“紅頭”、“脫黏”和“敗血”等癥狀。前期研究中，利用鰻鱺卵巢細(xì)胞系（eel ovary cell line，EO）從患“脫黏敗血綜合征”病鰻體內(nèi)分離出鰻鱺皰疹病毒（Anguillid herpesvirus，AngHV）［13］，證 實(shí) 了AngHV是鰻鱺“脫黏敗血綜合征”的致病病原［14］。

AngHV是皰疹病毒目（Herpesvirales）魚蛙皰疹病毒科（Alloherpesviridae）鯉皰疹病毒屬（Cyprinivirus）的線性雙鏈DNA病毒。前期的蛋白質(zhì)組學(xué)分析和進(jìn)一步的qPCR驗(yàn)證結(jié)果表明，感染AngHV后，鰻鱺皮膚黏液的RIG-I基因及其介導(dǎo)的RLRs信號(hào)通路上的多個(gè)基因被激活。本研究設(shè)計(jì)引物，從歐洲鰻鱺（Anguilla anguilla）體內(nèi)克隆出RIG-I基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)了RIG-I基因，以期為后期制備RIG-I多克隆抗體和進(jìn)一步探索RIG-I介導(dǎo)的天然免疫在鰻鱺抵御AngHV侵染過程中的作用機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)鰻鱺為福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)室內(nèi)養(yǎng)殖群體。2×Phanta Max Master Mix、5min TA／Blunt-Zero Cloning Kit購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，PrimeScriptTMII 1stStrand cDNA Synthesis Kit、DNA Marker購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 組織總RNA提取及cDNA合成

取歐洲鰻鱺的內(nèi)臟組織（肝臟、脾臟和腎臟），Trizol法提取總RNA，超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度；每個(gè)樣品取500 ng RNA，用PrimeScriptTMII1stStrand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2RIG-I基因的克隆

根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的歐洲鰻鱺RIG-I基因mRNA序列，用DNASTAR lasergene V7.1設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增歐洲鰻鱺RIG-I基因的引物對(duì)：RIG-I RW（ACCGGGGACGCGTTGAGTAAGC）和RIG-I FW（TATCCAAAGCGACGAGTGTGAAGC）。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠純化回收目的片段。將目的片段克隆至pCE2-TA／Blunt-Zero載體，用PCR鑒定后選取陽性菌株，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3RIG-I基因序列的生物信息學(xué)分析

用DNASTAR lasergene V7.1分析查找擴(kuò)增片段中的ORF序列，利用NCBI的BLAST在線工具對(duì)擴(kuò)增獲得的序列進(jìn)行同源性分析（https：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi？PROGRAM＝blastn＆PAGE_TYPE＝BlastSearch＆LINK_LOC＝blasthome）；用Protparam分析核苷酸及氨基酸序列的組成成分和理化性質(zhì)（http：／／web.expasy.org／protparam／）；用TMHMM2.0分析預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域（https：／／services.healthtech.dtu.dk／service.php？TMHMM-2.0）；用SignalP-5.0分析預(yù)測(cè)蛋白信號(hào)肽結(jié)構(gòu)（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）；用PSORT IIPrediction進(jìn)行亞細(xì)胞定位（http：／／psort.hgc.jp／form2.html）；用HNN預(yù) 測(cè) 蛋 白 質(zhì) 二 級(jí) 結(jié) 構(gòu)（http：／／npsa-pbil.ibcp.fr／cgi-bin／npsa_automat.pl？page＝／NPSA／npsa_hnn.html）；用CDD分析基因蛋白保守功能結(jié) 構(gòu) 域（https：／／www-ncbi-nlm-nih-gov.frodon.univ-paris5.fr／Structure／cdd／wrpsb.cgi）。

1.2.4 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)測(cè)序得到的歐洲鰻鱺RIG-I基因序列（GenBank序列號(hào)：ON873727），在其ORF序列前端添加NdeⅠ酶切位點(diǎn)、ATG起始密碼子和His tag，在末端添加終止密碼子及HindⅢ酶切位點(diǎn)（NdeⅠ--ATG--His tag--RIG-I--Stop codon--HindⅢ，Protein Length＝947），合成該序列后克隆至pET-30a載體，提取質(zhì)粒后雙酶切鑒定，獲得30a-RIG-I表達(dá)質(zhì)粒。

1.2.5RIG-I基因的誘導(dǎo)表達(dá)

將質(zhì)粒30a-RIG-I轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coliBL21（DE3）細(xì)胞，挑選陽性克隆，接種于LB液體培養(yǎng)基中。37℃、200 r·min-1培養(yǎng)至OD為0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol·L-1的IPTG，置于15℃培養(yǎng)16 h。離心收集細(xì)菌菌體，超聲破碎后分別取細(xì)胞裂解液、裂解液上清和裂解液沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.6 表達(dá)RIG-I的western blot驗(yàn)證

取誘導(dǎo)后的裂解液上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳［設(shè)置Multiple Tag（Purified）（南京金斯瑞生物科技有限公司）作為His-Tag陽性對(duì)照］，半干法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液37℃封閉1 h，TBST緩沖液洗膜后，置于1∶3 000倍稀釋于TBST中的鼠抗His-Tag單克隆抗體（英國(guó)艾博抗生物技術(shù)有限公司）室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜后，置于1∶15 000倍稀釋于TBST緩沖液中的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（美國(guó)Cell Signaling Technology，CST）室溫孵育1.5 h，TBST洗膜后，采用Super ECL Plus化學(xué)發(fā)光液（北京蘭博利德生物技術(shù)有限公司）顯色，用ChemiScope 6000 Touch成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 歐洲鰻鱺RIG-I基因的克隆

設(shè)計(jì)引物對(duì)RIG-IRW／RIG-IFW，利用PCR從合成的歐洲鰻鱺cDNA中擴(kuò)增出約3 361 bp的條帶（圖1），克隆至pCE2-TA／Blunt-Zero載體后測(cè)序，經(jīng)BLAST比對(duì)分析，證實(shí)成功克隆了歐洲鰻鱺的RIG-I基因。

圖1 歐洲鰻鱺RIG-I基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amp lification of Anguilla anguilla RIG-I

2.2 歐洲鰻鱺RIG-I基因的生物信息學(xué)分析

DNASTAR lasergene V7.1分析表明，歐洲鰻鱺RIG-I基因的ORF序列長(zhǎng)度為2 823 bp堿基，編碼940個(gè)氨基酸；Blast的結(jié)果表明，歐洲鰻鱺RIG-I基因與GenBank中日本鰻鱺（A.japonica）RIG-I基因的序列（MK838769.1）同源性為96.71%，有93 bp堿基發(fā)生點(diǎn)突變，對(duì)應(yīng)52個(gè)氨基酸發(fā)生點(diǎn)突變（圖2）。

圖2 歐洲鰻鱺RIG-I的基因和氨基酸序列Fig.2 Gene and am ino acid sequence of Anguilla anguilla RIG-I

Protparam分析顯示，歐洲鰻鱺RIG-I蛋白分子量約為108 kDa，等電點(diǎn)為6.31，屬酸性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)為42.58，較不穩(wěn)定；總平均親水性系數(shù)為-0.487，屬親水性蛋白；不存在跨膜結(jié)構(gòu)；無信號(hào)肽。亞細(xì)胞定位顯示，65.2%位于細(xì)胞質(zhì)，21.7%位于細(xì)胞核，8.7%位于細(xì)胞骨架，4.3%位于過氧化物酶體。HNN預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，RIG-I蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋（alpha helix）占47.55%，延伸鏈（extended strand）占15.11%，無規(guī)則卷曲（random coil）占37.34%。CDD分析結(jié)果表明，RIG-I蛋白有6個(gè)保守功能區(qū)，其在氨基酸序列上的位置及所屬蛋白家族如表1所示，2～91 aa和102～190 aa屬于DD超家族，254～456 aa屬于DEAD-like_helicase_N超家族；621～755 aa屬于DEAD-like_helicase_C超家族；471～604 aa和819～932 aa屬于不同的RIG-I_C家族。

表1 歐洲鰻鱺RIG-I蛋白的CDD分析結(jié)果Tab.1 CDD analysis of Anguilla anguilla RIG-I

2.3 歐洲鰻鱺RIG-I基因的原核表達(dá)

將添加了酶切位點(diǎn)和His-tag的RIG-I基因的ORF序列克隆至pET-30a載體，用NdeⅠ／HindⅢ進(jìn)行雙酶切（圖3），結(jié)果出現(xiàn)約2 844 bp的特異性條帶，表明成功構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒30a-RIGI。將質(zhì)粒30a-RIG-I轉(zhuǎn)化至E.coliBL21，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，與未經(jīng)誘導(dǎo)的載體相比，經(jīng)15℃誘導(dǎo)16 h后在全菌、裂解液上清和裂解液沉淀約108 kDa處均出現(xiàn)明顯的蛋白條帶，與預(yù)期歐洲鰻鱺RIG-I蛋白大小一致，且在細(xì)胞裂解液沉淀中的蛋白含量明顯高于上清，說明該蛋白可溶性較差，主要分布于包涵體內(nèi)（圖4-a）。進(jìn)一步的western blot分析顯示，含原核表達(dá)質(zhì)粒30a-RIG-I的誘導(dǎo)菌體可被His-Tag單克隆抗體特異性檢測(cè)出約108 kDa的蛋白條帶，這與表達(dá)蛋白的預(yù)期大小一致，而His-Tag對(duì)照檢測(cè)到的蛋白大小約為40 kDa（圖4-b），表明實(shí)現(xiàn)了歐洲鰻鱺RIG-I基因在E.coliBL21（DE3）中的表達(dá)。

圖3 質(zhì)粒30a-RIG-Ⅰ的酶切鑒定Fig.3 Restriction enzyme digestion of plasm id 30a-RIG-Ⅰ

圖4 SDS-PAGE和western blot分析歐洲鰻鱺RIG-I基因在大腸桿菌中的表達(dá)Fig.4 SDS-PAGE and western blot analysis of the expression of Anguilla anguilla RIG-I in E.coli

3 討論

相較于哺乳動(dòng)物，魚類的獲得性免疫系統(tǒng)分化不完全［15］，其抵御病原侵襲更依賴其天然免疫系統(tǒng)。大量研究表明，病毒侵染時(shí)，RIG-I介導(dǎo)的天然免疫在魚類抵御病毒侵襲的過程中發(fā)揮著重要作用［12］，CHEN等［16］的研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)壞死病毒（nervous necrosis virus，NNV）侵染斑馬魚的過程中，RIG-I被激活并特異性的介導(dǎo)II型IFN-I的產(chǎn)生；LIU等［17］通過轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，Ⅱ型鯉皰疹病毒（Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2）感 染 銀 鯽（Carassius auratus gibelio）后，RIG-I及其介導(dǎo)的信號(hào)通路內(nèi)的調(diào)節(jié)因子會(huì)被激活。前期研究中，通過蛋白質(zhì)組分析發(fā)現(xiàn)，感染AngHV的歐洲鰻鱺體內(nèi)RIG-I蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)，其介導(dǎo)的天然免疫信號(hào)通路上的多個(gè)基因也被激活，表明鰻鱺抵御AngHV侵染的過程中，RIG-I介導(dǎo)的天然免疫發(fā)揮著重要作用。FENG等［18］和HUANG等［19］均克隆鑒定了日本鰻鱺的RIG-I基因，但二者鑒定到的兩個(gè)日本鰻鱺RIG-I基因亞型AjRIG-I和AjRIG-Ib同源性僅為39%，本文鑒定到的歐洲鰻鱺RIG-I基因與AjRIG-Ib的同源性達(dá)到96.71%，僅部分堿基發(fā)生點(diǎn)突變，而與AjRIG-I的同源性較低，該結(jié)果可為研究鰻鱺RIG-I基因提供參考資料。

生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，RIG-I蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)中，較不穩(wěn)定，該結(jié)果與此前報(bào)道的RIG-I是病毒RNA胞質(zhì)傳感器［4］，未被dsRNA刺激時(shí)處于自抑制狀態(tài)［10］相一致。哺乳動(dòng)物RIG-I蛋白一般有4個(gè)保守功能區(qū)，從N端到C端依次為：兩個(gè)串聯(lián)的CARD結(jié)構(gòu)域，DEx D／H-box類RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域（CTD）。CDD預(yù)測(cè)結(jié)果中，歐洲鰻鱺RIG-I蛋白有6個(gè)保守功能區(qū)，從N端開始，前兩個(gè)均屬于DD超家族，第三和第五個(gè)分別屬于DEAD-like_helicase_N超家族和DEAD-like_helicase_C超家族，第四個(gè)和第六個(gè)屬于不同的RIG-I_C家族。DD超家族是蛋白質(zhì)互作模塊中最大的一類，在細(xì)胞凋亡、壞死和免疫細(xì)胞信號(hào)通路中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，包含4個(gè)亞科：DD，death effector domain（DED），CARD和pyrin domain（PYD）［20］。CARD_RIG-I_r1（cd08816）和CARD_RIG-I_r2（cd08817）兩個(gè)結(jié)構(gòu)域均屬于DD超家族中的CARD亞科，表明歐洲鰻鱺RIG-I蛋白與哺乳動(dòng)物的RIG-I蛋白類似，在N端也有兩個(gè)串聯(lián)的CARD。歐洲鰻鱺RIG-I蛋白的C端具有CTD結(jié)構(gòu)域，屬于RIG-I_C家族；但預(yù)測(cè)的結(jié)果中，歐洲鰻鱺RIG-I蛋白DEAD-like_helicase_N端結(jié)構(gòu)域和一個(gè)DEADlike_helicase_C端結(jié)構(gòu)域之間還有一個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)儆赗IG-I_C家族，該結(jié)構(gòu)域與C端的CTD結(jié)構(gòu)域?qū)儆诓煌腞IG-I_C家族，該結(jié)構(gòu)對(duì)歐洲鰻鱺RIG-I蛋白的功能有何影響，有待進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。