血流感染中大腸埃希菌的藥物敏感性、耐藥基因及同源性分析

王海如 侯亞彬 李艷芳 郝崇華

(山西醫科大學附屬人民醫院，山西省人民醫院，太原 030001)

血流感染是一種非常嚴重的全身性疾病，常伴隨著不良的臨床結局，不僅增加了患者死亡率，延長了住院時間，還增加了醫療費用[1]。大腸埃希菌是引起血流感染的主要病原菌，2018年中國細菌耐藥監測網(China Antimicrobial Surveillance Network,CHINET)數據顯示，大腸埃希菌在血流感染病原菌中占23.1%[2]。有研究發現大腸埃希菌血流感染后 30 d的全因死亡率約為16%，并隨著耐藥性的增加而增加[3]。產超廣譜β-內酰胺酶(extended spectrum betalactamases，ESBLs)是大腸埃希菌的主要耐藥機制[4]。本文重點對血流感染大腸埃希菌進行耐藥表型和分子流行學調查，為經驗性用藥和制定預防感染措施提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

收集2019年10月至2020年9月山西省人民醫院住院患者血培養中的大腸埃希菌，同一患者同一住院期間連續多次培養出大腸埃希菌時，只收集首次培養的菌株?？偣彩占?6株大腸埃希菌，其中男性患者34例，女性患者占42例，平均年齡(62.1±14.9)歲。

1.1.2 儀器與試劑

法國生物梅里埃公司的VITEK-2 Compact全自動微生物分析儀及配套試劑，美國Bio-Rad公司的ST1000 PCR擴增儀，德國Bruker公司的MicroflexMALDI- TOF MS全自動生物質譜檢測系統，英國Oxoid公司的藥敏紙片及M-H培養基。

1.2 方法

1.2.1 細菌鑒定及藥敏試驗

用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀進行菌種鑒定，用VITEK-2 Compact和相應的AST-GN16藥敏卡進行藥敏試驗和ESBLs確證試驗。藥敏結果參考CLSI M100[5]進行判讀。大腸埃希菌ACTT25922和ACTT35218做質控菌株。

1.2.2 耐藥基因檢測

對表型確認為ESBLs陽性的菌株進行耐藥基因的篩查，用聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)檢測ESBLs基因blaTEM、blaSHV、blaCTX-M-1,-2,-8,-9,-25組、blaVEB、blaGES、blaOXA-1,-2,-10組和blaPER，引物序列見表1[6]。提取DNA模板采用煮沸法，參考Zhao等[7]的步驟，PCR擴增反應體系和擴增條件參照文獻[6]，將陽性產物送上海生工生物工程股份有限公司測序，測序結果在BLAST數據庫比對，以確定其基因亞型。

表1 耐藥基因引物序列及目的片段大小Tab.1 PCR primers of the drug resistance genes and size of the target fragments

1.2.3 多位點序列分型(MLST)

通過PCR擴增大腸埃希菌的7個管家基因adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA。在EnteroBase數據庫中對管家基因序列進行在線比對，獲得管家基因的序列號，形成相應的等位基因譜，最后進行序列型分析。

1.2.4 統計分析

采用SPSS 25.0進行統計分析。我們將分類變量的值表示為它們所屬組的百分比。用卡方檢驗比較分類變量。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藥敏結果

76株大腸埃希菌對氨芐西林的耐藥率最高，達到90.7%，其次是環丙沙星、頭孢唑林、左氧氟沙星和頭孢曲松，耐藥率分別為69.7%、65.7%、63.1%和56.5%。對哌拉西林/他唑巴坦、厄他培南、亞胺培南、阿米卡星和替加環素全部敏感。76株大腸埃希菌中產ESBLs的檢出率為56.5%。產ESBLs菌株對氨芐西林、頭孢唑林、頭孢曲松全部耐藥，對環丙沙星、左氧氟沙星、氨曲南和慶大霉素的耐藥率分別為86.0%、83.7%、65.1%和60.4%，不產ESBLs菌株耐藥率最高的是氨芐西林，耐藥率是78.7%，其次是環丙沙星、復方磺胺甲惡唑、慶大霉素和左氧氟沙星，耐藥率分別為48.4%、45.5%、42.4%和36.3%。產ESBLs菌株對氨芐西林、頭孢唑林、頭孢曲松、頭孢吡肟、氨曲南、環丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率明顯高于非產ESBLs菌株(P＜0.05)，詳見表2。

表2 血流感染大腸埃希菌對常用抗菌藥物的耐藥率Tab.2 The resistance rates of Escherichia coli causing bloodstream infections to common antibiotics

2.2 分子特征

2.2.1 ESBLs基因檢測結果

在43株產ESBLs菌株中，總共檢出71個耐藥基因，其中僅攜帶一個ESBLs基因的有19株菌，攜帶兩個ESBLs基因的有20株菌，攜帶3個ESBLs基因的有4株菌。檢出率最高的是blaCTX-M-14(39.4%，28/71)基因，其次是blaTEM-1(28.2%，20/71)、blaCTX-M-15(14.1%，10/71)、blaOXA-1(9.8%，7/71)和blaCTX-M-55(8.5%，6/7 1)。未發現b l aSHV、b l aCTX-M-2,-8,-25組、blaGES、blaVEB、blaOXA-2,-10組或blaPER基因。

2.2.2 多位點序列分型(MLST)和GoeBURST分析

通過MLST分析，在76株分離株中鑒定出28種STs型。如圖1所示，具體的STs型為ST131(19.7%，15/76)、ST69(15.7%，12/76)、ST38(7.8%，6/76)、ST1193(6.5%，5/76)、ST648(5.2%，4/76)、ST73(5.2%，4/76)、ST46(3.9%，3/76)、ST405(3.9%，3/76)、ST117(2.6%，2/76)、ST450(2.6%，2/76)、ST2003(2.6%，2/76)、ST2448(2.6%，2/76)和其他是1株菌的ST10、ST44、ST95、ST155、ST167、ST393、ST490、ST410、ST457、ST493、ST542、ST773、ST1163、ST1284、ST2179、ST4503型。在產ESBLs菌株中，以ST131(27.9%，12/43)為主，在不產ESBL菌株中，以ST69(24.2%，8/33)為主。

圖1 最小生成樹(MST)，每個圓的面積對應于本研究的MLST數據中ST的出現頻率Fig.1 Minimum spanning tree(MST),the area of each circle corresponds to the frequency of St in MLST data

3 討論

耐藥性細菌的出現和傳播一直是公眾關注的問題。研究報告顯示，抗生素耐藥性細菌每年在全世界造成大約70萬人死亡，如果不采取有效行動，預計到2050年每年將造成1000萬人死亡[8]。同濟醫院1998—2017年耐藥監測數據顯示大腸埃希菌產生ESBLs的比例顯著增加，從1998—2002年的0增加到2008—2012年的76.2%[9]。不同醫院之間的微生物流行病學和耐藥率可能存在很大差異[10]，臨床醫生在選擇適當的抗菌素時應考慮當地微生物流行病學。本研究分析了山西省人民醫院血流感染中大腸埃希菌的藥物敏感性、耐藥基因分布及菌株間的同源性特征。

本研究表明，大腸埃希菌對氨芐西林、頭孢唑林、頭孢曲松、慶大霉素、環丙沙星和左氧氟沙星等常用抗生素高度耐藥，但對碳青霉烯類、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星和替加環素全部敏感，與樓頌羔等的報道一致[11]，建議這些藥物作為早期經驗治療的選擇。本研究中產ESBLs大腸埃希菌的檢出率為56.5%，低于Ma等[12]報道的河南產ESBLs大腸埃希菌的檢出率61.9%和Wang等[6]報道的上海產ESBLs大腸埃希菌的檢出率67.8%，但是高于意大利產ESBLs大腸埃希菌的檢出率37.6%[13]和日本產ESBLs大腸埃希菌的檢出率26.1%[14]。不同地區大腸埃希菌產 ESBLs 檢出率不同，這種差異形成的原因可能與不同醫院對感染控制力度不同、使用抗生素情況不同以及各地衛生條件不同等因素有關[15]。

本研究中，76株大腸埃希菌中多重耐藥菌株有56株，其中42株是產ESBLs大腸埃希菌，14株為不產ESBLs菌株。43株產ESBLs大腸埃希菌中40株攜帶blaCTX-M基因，這些菌株對氨芐西林、頭孢唑林、頭孢曲松全耐藥，對環丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率高于80%。在全球范圍內，大腸埃希菌中最常見的ESBLs基因類型是blaCTX-M基因[16]，本研究的結果與之相符。在我們的研究中，blaCTX-M-14是blaCTX-M的主要亞型，其次是blaCTX-M-15和blaCTX-M-55，而在德國和荷蘭[17-18]的研究顯示，blaCTX-M-15是blaCTX-M的主要亞型，這表明，大腸埃希菌blaCTX-M基因的亞型分布存在地理差異。43株產ESBLs大腸埃希菌中有19株菌攜帶一個ESBLs基因，有20株菌同時攜帶兩個ESBLs基因，有4株菌同時攜帶3個ESBLs基因，進一步證明我院大腸埃希菌耐藥情況嚴重，多重耐藥模式復雜。

GoeBURST分析結果表明，引起血流感染的大腸埃希菌并不是由獨特的祖先背景進化而來的，存在遺傳多樣性。我們的結果顯示，在產ESBLs菌株中主要的ST型是ST131型，ST131型是目前公認的全球流行性克隆群和多重耐藥譜系之一[19]，Ranjan等[20]的研究發現ST131型大腸埃希菌有更強的致病性和更好的生存能力，這有助于ST131的流行，產ESBLs大腸埃希菌數量的大量增加可能與ST131的克隆擴增有關[21]。本研究中80%的ST131型菌株攜帶blaCTX-M基因，說明ST131型與blaCTX-M有很強的相關性，這與Alireza等[22]的研究一致。我們的結果顯示，在不產ESBLs菌株中，主要的ST型是ST69型，而荷蘭van Hout等[23]的一項研究表明，ST73是不產ESBLs菌株中最常見的序列類型，與我們的研究不一致，這表明，不同地區大腸埃希菌的ST型分布存在明顯差異。我們的研究還發現ST131型菌株對氨芐西林、頭孢唑林、頭孢曲松、頭孢吡肟、環丙沙星、左氧氟沙星、氨曲南和慶大霉素的耐藥率高，ST69型菌株對氨芐西林、慶大霉素和復方磺胺甲惡唑的耐藥率高，與Souza等[24]的研究結果一致，這表明不同ST型對不同藥物的敏感性存在一定差異，臨床需根據藥敏實驗結果選擇合適的抗菌藥物。

綜上所述，本院大腸埃希菌對大多數常用抗生素具有耐藥性。經驗性用藥，碳青霉烯類、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星和替加環素可能是較好的選擇。本院血流感染中大腸埃希菌主要流行的耐藥基因型為blaCTX-M型，MLST分析表明，菌株間存在遺傳多樣性。合理使用抗生素和監測病原體的流行病學特征是必要的，以減少耐藥細菌的擴散和流行。