基于全基因組測序的耐碳青霉烯類抗生素鮑曼不動桿菌耐藥基因、毒力因子及同源性分析

胡小騫 王琴

(安徽醫科大學第二附屬醫院，合肥 230601)

鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii,AB)是一種易引起醫院感染的非發酵革蘭陰性桿菌，近年來在重癥監護病房的檢出率居高，主要感染免疫力低下的重癥患者、侵入性治療的患者及抗菌藥物廣泛使用的患者，易引起腦膜炎、肺炎、腹膜炎、菌血癥等疾 病[1-2]，感染患者的死亡率高達35%[3]。AB在環境中可長期存在，當感控措施落實不到位時，會增加患者間交叉傳播以及耐藥菌間傳播的機會[4]。隨著抗菌藥物的廣泛使用，AB的耐藥性日漸嚴重，其對碳青酶烯類的耐藥率逐年增高[5-6]，耐碳青霉烯類抗生素鮑曼不動桿菌(carbapenem-resistantAcinetobacter baumannii,CRAB)的檢出率逐漸增高，其在社區中、醫院內傳播的機會不斷增加，對醫療機構構成了全球性威脅[7]。本研究收集該院重癥監護病房、神經外科住院患者分離的CRAB，應用全基因組測序技術對其攜帶的耐藥基因、毒力因子及同源性進行分析，為臨床CRAB感染防控措施及抗菌藥物的合理使用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

收集該院2020年1月—3月ICU、神經外科分離的所有醫院感染CRAB菌株，剔除同一患者的重復菌株及入院48 h內檢出的社區感染菌株，共11株。菌株納入依據為1月至3月期間該院ICU發現7例CRAB醫院感染的患者，進一步調查發現神經外科有4例CRAB醫院感染的患者與7例ICU患者存在時間及空間的交集，將此11株CRAB納入研究。標本來源分別為痰(10株)、血(1株)。11例患者中男性11例(100%)，見表1。以大腸埃希菌ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCC700603，銅綠假單胞菌ATCC27853，陰溝腸桿菌ATCC700323為質控菌株。

表1 11株CRAB菌株的分布情況Tab.1 The distribution of 11 strains of CRAB

1.1.2 儀器與試劑

法國生物梅里埃VITEK-2 Compat全自動細菌分析系統，英國Biochrom超微量分光光度計，上海一恒科學儀器有限公司恒溫培養搖床，美國Bio-Rad電泳儀，美國Bio-Rad凝膠成像系統。藥敏紙片、M-H培養基購自Oxoid公司，DNA Marker D、4S Red plus核酸染色劑、上樣緩沖液購自上海生工生物工程股份有限公司，細菌DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，質控菌株購自國家衛健委臨床檢驗中心。

1.2 方法

1.2.1 細菌鑒定及藥敏實驗

應用法國VITEK-2 Compat全自動細菌分析系統和配套試劑GN/GN13，進行革蘭陰性菌的鑒定及藥敏試驗。參照臨床實驗室標準化研究所(Clinical and laboratory standard institute,CLSI)2019年標準對藥敏結果進行判定，使用微量肉湯稀釋法(MIC法)對亞胺培南、慶大霉素、頭孢菌素、妥布霉素、復方磺胺甲惡唑、左氧氟沙星和環丙沙星進行藥敏試驗，使用K-B紙片擴散法對美羅培南和阿米卡星進行藥敏試驗，CRAB藥敏結果判定標準為對任一種碳青霉烯類抗生素耐藥的鮑曼不動桿菌。

1.2.2 細菌基因組DNA提取

復蘇CRAB菌株于LB固體培養基上，37℃培養24 h后，挑取單克隆CRAB菌株于LB液體培養基中，37℃、220 r/min搖菌過夜。取細菌培養液1 mL，10000 r/min離心1 min，吸凈上清液，保留菌體沉淀，使用DNA提取試劑盒提取菌株DNA。

1.2.3 基因組DNA提取物質量控制標準

將DNA提取產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并用超微量分光光度計檢測純度和濃度。純度要求菌株DNA產物的A260:A280于1.8～2.0范圍內，避免RNA污染。DNA濃度≥20 ng/μL，條帶清晰無雜帶，總量在1.0～2.0 μg范圍內。

1.2.4 細菌全基因組測序

通過Illumina Hiseq2500第二代高通量測序平臺進行2×100 bp Paired-End測序，基于Illumina平臺的測序，是對核酸提取樣本進行建庫、擴增測序、質控的3個主要步驟。

1.2.5 測序結果組裝

在Linux或Centos系統中運行SPAdes-2.0軟件將測序原始FASTQ結果拼接為FASTA文件，運行命令參考SPAdes-2.0軟件網址https://github.com/ablab/spades。

1.2.6 耐藥基因篩選

應用丹麥技術大學(DTU)基因組流行病學中心(Center for genomic epidemiology,CGE)(https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/)的ResFinder 4.0工具，對11株CRAB的contigs進行耐藥基因篩選，獲得其攜帶的耐藥基因。應用MORPHEUS(https://software.broadinstitute.org/morpheus/)在線制作11株CRAB的耐藥基因熱圖，實現耐藥基因分布可視化。

1.2.7 毒力因子篩選

應用Linux系統運行Kaptive軟件檢測CRAB菌株的莢膜型，應用中國衛生健康委員會創建的病原生物學系統生物學重點實驗室、CAMS＆PUMC病原生物學研究所毒力因子數據庫(Virulence factors of pathogenic bacteria,VFDB)(http://www.mgc.ac.cn/cgi-bin/VFs/v5/main.cgifunc=VFanalyzer)的VFanalyzer在線工具，對11株CRAB進行毒力因子篩選。

1.2.8 同源性分析

應用Linux系統運行MLST軟件，MLST軟件將菌株的FASTA文件應用BLAST算法與PubMLST分子分型和微生物基因組多樣性的公共數據庫進行(https://pubmlst.org/)比對，運行命令參考MLST軟件(https://github.com/tseemann/mlst)，對細菌基因組的gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB7個管家基因進行對齊分類，每個基因組的每種管家基因被命名為一個隨機整數，各種管家基因命名整數的唯一組合(等位基因譜)即為一種序列類型(ST型)，根據細菌ST型初步分析其同源性。

同時，基于全基因組序列的單核苷酸多態性(single-nucleotide polymorphism,SNP)分析，以1號菌株序列作為參考，使用CGE的CSI Phylogeny 1.4工具(https://cge.cbs.dtu.dk/services/CSIPhylogeny/)對所有菌株序列進行SNP分析，應用FigTree v1.4.4軟件針對分析結果構建11株CRAB的最大似然樹，按同源性大小分組，分析其同源性。

1.2.9 統計學分析

應用WHONET5.6軟件對數據進行分析處理，計數資料以例數進行描述。

2 結果

2.1 細菌藥敏結果

11株CRAB均為多重耐藥菌，其中11株對亞胺培南、美羅培南、頭孢菌素和環丙沙星均表現耐藥，而對阿米卡星和左氧氟沙星耐藥的菌株株數較少，分別為4株和2株，見表2。

表2 CRAB對常用抗菌藥物的耐藥情況(株數)Tab.2 Resistance of CRAB to commonly used antibacterial drugs(number of plants)

2.2 耐藥基因分析結果

通過對11株CRAB進行WGS分析，共發現18種耐藥基因，包括碳青霉烯酶耐藥基因、β-內酰胺酶耐藥基因、多種外排泵相關耐藥基因及抗菌藥物修飾酶耐藥基因，見圖1和表3。碳青霉烯酶耐藥基因以blaOXA-23和blaOXA-66為主，11株(100.0%)均攜帶此型。11株(100.0%)均攜帶β-內酰胺酶耐藥基因，包括blaADC-25和blaTEM-1D。檢出外排泵相關基因如tet(B)，以及抗菌藥物修飾酶耐藥基因如aadA1、aph(3″)-Ib、aph(3＇)-Ia、aph(6)-Id、aac(3)-Ia和aac(6＇)-Ib3，7種氨基糖苷類耐藥基因中，11株(100.0%)攜帶aadA1、aph(3″)-Ib、aph(3＇)-Ia和aph(6)-Id，9株(81.8%)攜帶aac(3)-Ia，5株(45.5%)攜帶aac(6＇)-Ib3和armA。檢出大環內酯類耐藥基因mph(E)(10株)、msr(E)(10株)，磺胺類耐藥基因sul1(11株)，喹諾酮類耐藥基因aac(6＇)-Ib-cr(5株)，四環素耐藥基因tet(B)(11株)，氯霉素耐藥基因catB8(5株)，消毒劑耐藥基因qacE(11株)。

表3 CRAB攜帶的耐藥基因型分布情況Tab.3 The distribution of drug-resistant genotypes carried by CRAB

圖1 11株CRAB耐藥基因熱圖Fig.1 Heat map of 11 strains of CRAB resistant genes

2.3 毒力因子分析結果

通過WGS分析，發現11株CRAB均為K22莢膜型，其均攜帶多種毒力因子，包括外膜孔蛋白(OmpA)、脂多糖(LpsB)、生物膜(CsuABCDE、Bap和PgaABCD)、外排泵(AdeFGH)、磷脂酶(Plc、PlcD)、不動桿菌素生物合成蛋白(BauABCDEF)、外膜醋酸桿菌素蛋白(BauABCDEF)、腸桿菌素合成酶(EntE)、血紅素加氧酶(HemO)、群體感應(QS系統)蛋白(AbaIR)、菌毛調節因子(BfmRS)、青霉素結合蛋白G(PbpG)和過氧化氫酶(KatA)。

2.4 同源性分析結果

11株CRAB均為ST 2-K22型，其最大似然樹構建結果如圖2所示，依據樹分支節點的bootstrap值，將bootstrap值≥0.5的分支菌株分為一組[8-10]，11株CRAB按同源性差異分成5組克隆株，10號為A組，7號為B組，1、3、4、5、6、8和9號為C組，11號為D組，2號為E組。C組組內同源性關系較近，組內的分支節點上的bootstrap值均≥0.7，C組感染患者的流行病學調查結果顯示，7位感染患者均為入住ICU后分離出CRAB，其ICU住院時間存在先后或交集關系，其中6號與8號床位相同，其他感染患者的床號相近。

圖2 11株CRAB最大似然樹Fig.2 Phylogenetic tree diagram of 11 strains of CRAB

3 討論

本研究對11株CRAB的藥敏結果顯示其耐藥形勢較嚴峻，其對臨床常用抗菌藥物呈現耐藥，除了6株對妥布霉素、復方磺胺甲惡唑敏感，7株對阿米卡星敏感外，對其他抗菌藥物敏感的菌株株數均較低。說明臨床應加強抗菌藥物合理規范使用的管理，減少抗菌藥物對耐藥菌的篩選機會，否則將會面臨無藥可用的局面。

CRAB的耐藥機制較為復雜，主要包括外排泵的過度表達、膜孔通道蛋白表達下調、藥物作用靶位變化、產碳青霉烯酶等方式實現耐藥[11-15]。其中，產碳青霉烯酶是CRAB重要的耐藥機制之一，本研究中碳青霉烯酶耐藥基因blaOXA-23和blaOXA-66檢出率均為100%，未檢出其他類型碳青霉烯酶耐藥基因。blaOXA-23和blaOXA-66屬于Ambler D類酶，blaOXA-23通常由質粒或染色體介導傳播[16-17]，位于blaOXA-23上游的ISAba1基因對其具有協調作用[18-19]，ISAba1作為插入序列可使carO基因失活，致使膜孔蛋白carO缺失[20]，阻止藥物進入菌株內部而產生耐藥。說明blaOXA-23和blaOXA-66為該院CRAB對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要因素之一，這與國內外相關報道一致[12,17,21-23]。本研究結果中的aac(3)-Ia和aac(6＇)-Ib3屬于氨基糖苷乙酰轉移酶(AACs)基因，其檢出率分別為81.8%和45.5%，檢出率高于國內相關研究[24]，氨基糖苷核苷轉移酶(ANTs/aad)基因aadA1、以及氨基糖苷磷酸轉移酶(APHs)基因aph(3″)-Ib、aph(3＇)-Ia和aph(6)-Id的檢出率均為100.0%，說明這些基因為該院流行的主要耐藥基因，其可通過多種途徑在菌株間傳播，如轉座子、整合子及質粒等[22]。armA屬于氨基糖苷類耐藥基因中的16S rRNA甲基化酶基因，是AB耐氨基糖苷類藥物的主要因素之一[25]，本研究中的檢出率為45.5%，臨床科室應加強氨基糖苷類抗菌藥物的合理使用，減少此類藥物對AB的選擇作用。喹諾酮類耐藥基因aac(6＇)-Ib-cr由氨基糖苷乙酰轉移酶基因aac(6＇)-Ib突變而來，可由質粒介導乙酰化含游離氨基的藥物，可同時對氨基糖苷類和喹諾酮類藥物進行酶解，其檢出率為45.5%。四環素耐藥基因tet(B)檢出率為100.0%，Vilacoba等[26]發現tet(B)可與插入序列ISCR2協同實現耐藥基因的傳播。以上研究顯示該院CRAB耐藥基因類別較多、機制復雜，說明臨床及相關主管部門應加強抗菌藥物的管理，合理使用抗菌藥物，避免藥物濫用情況的發生。

AB的毒力因子主要包括磷脂酶、膜孔蛋白、脂多糖、鐵載體及生物被膜相關蛋白等。本研究中11株CRAB均攜帶多種毒力因子。其中，生物膜因子包括CsuABCDE、Bap和PgaABCD，可保護細菌以適應乏養環境，CsuE和PgaB是其常見流行因子[27]，其他因素也能促使生物膜的形成，如上調Csu和菌毛調節因子(BfmR)[28]、外排泵AdeFGH基因的過度表達等[29]。膜孔蛋白因子(OmpA)能夠輔助菌株形成生物膜，并參與菌株對宿主的黏附作用，甚至能夠誘導凋亡級聯反應的發生[30]。脂多糖因子(LpsB)可提高菌株對宿主血清補體的抵抗力，以實現對宿主細胞的免疫逃逸，還可以預防宿主抗菌肽LL-37對菌株的殺傷作用[2,31]。不動桿菌素生物合成蛋白包括BasABCDFGHIJ，其中BasD能夠促進菌株對于宿主細胞的鐵攝取，保障菌株能量供應及持續生存。外膜醋酸桿菌素蛋白BauA與BasD作用相似[32]。另外，群體感應(QS系統)蛋白(AbaIR)可輔助菌株表面運動以增強毒力，相關研 究[33]表明菌株主要依賴AbaI介導的群體感應以實現運動能力。青霉素結合蛋白G(PbpG)基因可參與合成Pbp7/8[11]，有研究[34]表明Pbp7/8的缺失可能破壞肽聚糖結構，從而影響菌株對宿主的防御作用。血紅素加氧酶HemO會促進CRAB對宿主血紅素及鐵的有效利用[35]，實現菌株的生存維持。本研究結果顯示該院CRAB毒力機制復雜多樣，各類毒力因子賦予菌株強大的生存力及侵襲力，說明實施有效防控措施以控制CRAB的傳播至關重要。

本研究結果顯示11株CRAB均為ST 2-K22莢膜型，與Rezaei等[36]的研究結果相似。最大似然樹結果顯示C組的1、3、4、5、6、8和9號菌株同源性較高，提示為該院CRAB的優勢克隆株。有研究發現AB在醫療環境中可長期存活，在干燥環境中可存活60 d，當消毒隔離措施落實不到位，醫務人員手衛生不達標等情況發生時，此類環境可能成為CRAB定植和交叉感染的溫床[37]。同源性分析結果顯示，C組的1、8號感染患者先于2019年12月在ICU入住治療，轉回神經外科后分離出CRAB，3、4、5、6、9號感染患者隨后入住ICU治療，并在ICU住院期間分離出CRAB，7位感染患者的ICU入住床號較為相近，其中，6號與8號床位相同。說明不能排除環境及醫務人員等因素導致CRAB在ICU內的傳播，此次傳播原因可能與ICU的床單元消毒不到位、醫務人員手衛生不規范以及醫務人員無菌操作不達標有關。醫院相關管理部門及臨床科室應加強耐藥菌防控的管理，包括嚴格落實病區的消毒隔離措施，嚴格執行無菌操作，規范手衛生等，醫務人員應加強對國內、外細菌耐藥趨勢的了解，合理使用抗菌藥物[38]。

多重耐藥菌的耐藥基因、毒力因子及親緣性關系對于細菌耐藥性流行病學的研究至關重要，傳統的技術方法如PCR及qPCR基因芯片、脈沖場凝膠電泳等的分析結果不全面、靈活性低、耗時長、操作復雜，具有一定的局限性。WGS結合生物信息分析的模式能夠快速全面地識別細菌的耐藥性及毒力機理，精準地呈現菌株間的親緣性關系，具有靈敏度、特異性、準確性高的特點，對于研究基因組的復雜性、多樣性以及提高各類細菌發展進程的認知具有重要意義。WGS分析結果與流行病學調查的結合能夠快速、準確地確認院感暴發、追蹤感染源、明確傳播路徑，為耐藥菌的防控提供更有效的目標干預信息，對于醫院感染暴發的調查具有重要意義，提升了醫院感染防控的技術水平。

本研究的菌株樣本量偏少，在開展耐藥性和毒力的統計學研究方面存在不足。同時，本研究選用的ResFinder 4.0數據庫對于部分基因及突變基因的比對不全面，如喹諾酮類耐藥基因gyrA、gyrB和parC等，使本研究在預測菌株的耐藥性方面具有一定的局限性。后續將收集更多科室的不同種類標本，應用多樣化的技術方法對菌株進行耐藥性、毒力及同源性的分析。

綜上所述，本研究中的CRAB對大多數抗菌藥物均耐藥，同時攜帶多種耐藥基因，耐藥形勢較為嚴峻。其攜帶的毒力因子較多，毒力機制較為復雜，給臨床治療帶來了挑戰。CRAB菌株間存在一定的同源性，應加強對CRAB的耐藥性監測及主動篩查，落實有效的感染防控措施，遏制耐藥菌在醫院內的傳播。