噬菌體培養(yǎng)與鑒定方法研究進(jìn)展

郭文瓊 盧家輝 潘伍亮 樂(lè)率

(1 成都醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，成都 610500；2 成都醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，成都 610500；3 陸軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，重慶 400038)

噬菌體廣泛存在于自然環(huán)境和人體，被認(rèn)為是地球上數(shù)量最多的生命體，數(shù)量被估算為1031左右，但是被分離、鑒定和測(cè)序的噬菌體只有幾萬(wàn)株[1]。噬菌體也是生命科學(xué)研究的熱門對(duì)象，基于噬菌體的研究發(fā)現(xiàn)了限制修飾酶、CRISPR-Cas系統(tǒng)等分子生物學(xué)工具[2-3]。新型噬菌體的分離、鑒定，有望拓展新的研究領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)新的生物學(xué)規(guī)律，是進(jìn)一步開(kāi)拓噬菌體研究的基石。本文就噬菌體分離鑒定的前沿需求、裂解性和溶原性噬菌體分離鑒定方法進(jìn)展進(jìn)行綜述，為噬菌體分離鑒定提出方法學(xué)的總結(jié)，并對(duì)未來(lái)研究進(jìn)行展望，為開(kāi)拓噬菌體研究新領(lǐng)域提供參考。

1 新型噬菌體培養(yǎng)與鑒定的研究意義

近年來(lái)，噬菌體的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究都在快速發(fā)展，新的研究領(lǐng)域催生了噬菌體分離鑒定的新需求[3]，尤其是以下幾個(gè)方面的研究亟需以大量新型噬菌體分離鑒定為基礎(chǔ)。

1.1 人體噬菌體組學(xué)研究

人體擁有巨大的微生物群落，稱為微生物組，微生物組中包括的大量病毒被統(tǒng)稱為“病毒組”[4-5]。近年來(lái)，使用宏基因組測(cè)序和其他方法對(duì)人類病毒組的研究已經(jīng)闡明了不同身體部位人類病毒組的多樣性，病毒組主要由噬菌體組成，且與健康、疾病的關(guān)系被逐漸揭示。例如，炎性腸病患者的腸道病毒組會(huì)出現(xiàn)有尾噬菌體數(shù)量增加而微小噬菌體減少的情況，這一變化可能是由于細(xì)菌種群生態(tài)失調(diào)所導(dǎo)致的[5]。盡管關(guān)注度越來(lái)越高，但典型的病毒組研究中的大多數(shù)序列數(shù)據(jù)仍未被識(shí)別，這些未被探索的噬菌體“暗物質(zhì)”對(duì)微生物組及其對(duì)人體的影響還不清楚，是當(dāng)前研究的熱門領(lǐng)域。不僅如此，噬菌體還可用于調(diào)控腸道微生物組，調(diào)節(jié)腸道代謝組，提示噬菌體捕食對(duì)哺乳動(dòng)物宿主的影響，說(shuō)明噬菌體在治療腸道疾病中具有潛在價(jià)值[6-7]。

1.2 超級(jí)細(xì)菌的噬菌體治療

隨著抗生素的大量使用，越來(lái)越多的泛耐藥、甚至全耐藥細(xì)菌不斷涌現(xiàn)，給臨床治療帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。噬菌體是治療“超級(jí)細(xì)菌”感染的重要武器，近年來(lái)，歐美和我國(guó)都相繼開(kāi)展了噬菌體治療臨床試驗(yàn)，利用敏感的噬菌體治療“超級(jí)細(xì)菌”感染，取得重要進(jìn)展[8-10]。但是，由于噬菌體的特異性太高，因此每次治療前都需要針對(duì)患者的病原體，分離能夠特異性識(shí)別該細(xì)菌的噬菌體，而這一過(guò)程繁瑣且耗費(fèi)大量人力物力。因此，亟需一種快速、高效分離噬菌體的方法。

1.3 環(huán)境噬菌體研究

自然環(huán)境中存在大量的噬菌體，如，海洋、沉積物和土壤等[11-13]。噬菌體的多樣性研究才剛剛開(kāi)始，目前的噬菌體研究的采樣是局限的，許多環(huán)境仍然是未知的，因此，全球噬菌體多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)培養(yǎng)分離株所代表的多樣性。而這些自然界存在的噬菌體的研究，將有助于人們更好地了解生態(tài)系統(tǒng)和進(jìn)化規(guī)律。宏基因組學(xué)研究為自然環(huán)境的噬菌體研究提供了高通量的手段，一項(xiàng)研究分析了來(lái)自3042個(gè)地理上不同的樣本，獲得超過(guò)5 Tb的病毒宏基因組序列數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了超過(guò)12.5萬(wàn)個(gè)DNA病毒基因組，包括迄今為止確定的最大噬菌體，結(jié)果突出了廣泛的全球病毒多樣性，但是，其中大多數(shù)基因功能還是未知，大量的噬菌體也未被分離鑒定[11]。

1.4 農(nóng)牧食品行業(yè)的噬菌體研究

噬菌體在種植業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)和食品加工業(yè)中有重要的應(yīng)用價(jià)值。如，畜牧養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的添加會(huì)帶來(lái)細(xì)菌耐藥性的嚴(yán)峻問(wèn)題，而噬菌體可用于控制細(xì)菌感染，代替或減少抗生素的使用。噬菌體對(duì)葉際病原菌也有防控潛力，美國(guó)已批準(zhǔn)用噬菌體控制丁香假單胞菌引起的番茄和胡椒的葉片黑斑病。

2 裂解性噬菌體分離鑒定的經(jīng)典方法及其局限性

大量噬菌體的前沿領(lǐng)域都需要以新噬菌體分離鑒定為基石，噬菌體的分離鑒定是噬菌體研究的起點(diǎn)。噬菌體的發(fā)現(xiàn)是基于噬斑實(shí)驗(yàn)：噬菌體裂解細(xì)菌后在平板上形成肉眼可見(jiàn)的空斑。其操作非常簡(jiǎn)單：將宿主菌與噬菌體混合后，加入半固體培養(yǎng)基，然后倒在固體平板上，培養(yǎng)一段時(shí)間后，噬菌體裂解細(xì)菌并形成肉眼可見(jiàn)的噬斑，詳細(xì)的步驟可參考相關(guān)文獻(xiàn)[14]。

這一方法引領(lǐng)了噬菌體研究100余年，簡(jiǎn)單易行，被寫入全球各地的教科書(shū)，導(dǎo)致形成思維定式，研究人員總想用噬斑實(shí)驗(yàn)來(lái)分離所有噬菌體。但在科研實(shí)踐中，經(jīng)常無(wú)法用噬斑實(shí)驗(yàn)分離到特定細(xì)菌的噬菌體。因此，需要從噬菌體感染的過(guò)程來(lái)分析噬菌體的生活周期、噬斑形成機(jī)制，最后提出新的方法或?qū)Σ撸瑏?lái)分離、鑒定新的噬菌體。

噬菌體的生活周期，包括吸附、注入基因組、生物合成和裂解釋放等幾個(gè)部分。而噬菌體能否感染一個(gè)特定細(xì)菌，取決于能否吸附、能否利用細(xì)菌的分子機(jī)器進(jìn)行生物合成、是否會(huì)被細(xì)菌的抵抗系統(tǒng)清除[1]。因此，需要從采樣樣本、細(xì)菌、培養(yǎng)條件、鑒定方法等不同層面來(lái)思考噬菌體分離鑒定的方法(表1)。

3 培養(yǎng)與鑒定新型裂解性噬菌體的策略

3.1 增加噬菌體分離的樣本來(lái)源

噬菌體不能脫離細(xì)菌而繁殖，因此，分離特定細(xì)菌的噬菌體，首先需要選擇該細(xì)菌比較富集的樣本，這種環(huán)境中存在相應(yīng)噬菌體的概率也較大。如，銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌等細(xì)菌是醫(yī)院常見(jiàn)的病原體，在醫(yī)院環(huán)境中廣泛存在[15-16]。在醫(yī)院人員和患者洗手和打掃衛(wèi)生后，這些細(xì)菌都最終匯集到醫(yī)院污水中。因此，消毒前的醫(yī)院污水富含這些耐藥性較強(qiáng)的“超級(jí)細(xì)菌”的同時(shí)，也往往含有大量的對(duì)應(yīng)的噬菌體。從醫(yī)院污水中比較容易分離出銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌等“超級(jí)細(xì)菌”的噬菌體[17]。但是，一個(gè)醫(yī)院或一個(gè)地區(qū)的細(xì)菌有一定的特異性，因此，噬菌體也具有較強(qiáng)的特異性。因此，一個(gè)醫(yī)院的污水中并不能分離到可以感染所有銅綠假單胞菌菌株的噬菌體。此時(shí)，可以去不同醫(yī)院或不同城市的醫(yī)院取污水進(jìn)行噬菌體分離[18]。例如，上海噬菌體與耐藥研究所進(jìn)行噬菌體治療時(shí)，偶爾也會(huì)遇到患者的細(xì)菌不能被已有噬菌體裂解的問(wèn)題，且在上海幾家醫(yī)院污水中無(wú)法分離到噬菌體，而在深圳醫(yī)院污水中則分離到了該患者細(xì)菌的噬菌體[10]。此外，河水、海水中通常沒(méi)有這些“超級(jí)細(xì)菌”，在這些自然水樣中，分離到銅綠假單胞菌噬菌體的概率較低。因此，需要選擇目標(biāo)細(xì)菌最可能廣泛存在的樣本進(jìn)行噬菌體分離。例如，Hryckowian等[19]從美國(guó)和孟加拉國(guó)的4個(gè)污水處理廠的未處理污水中，成功分離到27株不同的擬桿菌屬細(xì)菌Bacteroides thetaiotaomicron的噬菌體。

古細(xì)菌(Archaea)是一類特殊的原核生物，在自然界中廣泛存在，包括一些極端的生態(tài)環(huán)境中。因此，從極端環(huán)境樣本中可分離到古菌的噬菌體[20-21]。其分離方法與細(xì)菌噬菌體的分離類似，如研究人員先采集鹽礦的鹽水和鹽晶體，溶解濾過(guò)后與鹽古菌混合，再進(jìn)行噬斑實(shí)驗(yàn)，最后分離到大量鹽古菌的噬菌體，并揭示了鹽古菌噬菌體的多樣性[21]。

3.2 擴(kuò)大篩選的菌株數(shù)量

噬菌體是有極強(qiáng)的特異性的，這種特異性通常是菌株水平的特異性，也就是一個(gè)噬菌體通常只能感染一種細(xì)菌中的部分菌株。這種特異性的機(jī)制是非常復(fù)雜的，總的來(lái)說(shuō)，取決于兩大機(jī)制：首先是噬菌體對(duì)細(xì)菌的吸附能力，其具有很強(qiáng)特異性。其次，是細(xì)菌含有大量的抵抗噬菌體的機(jī)制，這將導(dǎo)致噬菌體無(wú)法繁殖形成噬斑[22]。因此，在分離特定細(xì)菌的噬菌體時(shí)，應(yīng)該先盡量多地收集目標(biāo)菌株，用不同的菌株進(jìn)行分離，如不同血清型的菌株，這將增加分離到的概率。

Goller等[18]首先收集了117株不同的葡萄球菌菌株，然后從大量污水環(huán)境中分離了94種新型葡萄球菌噬菌體。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)噬菌體只有一個(gè)分離宿主，即裂解譜很窄，只能用特殊的菌株進(jìn)行分離鑒定，而部分噬菌體則表現(xiàn)為廣宿主譜，可以跨種感染不同細(xì)菌，這種廣譜噬菌體對(duì)基因水平轉(zhuǎn)移和生態(tài)學(xué)都有一定的影響。

此外，還可以選擇缺乏抵抗噬菌體機(jī)制的宿主來(lái)進(jìn)行分離，則分離到的噬菌體概率會(huì)增加。Maffei 等[23]將大腸埃希菌的O抗原、所有的噬菌體抵抗系統(tǒng)(限制修飾系統(tǒng)、流產(chǎn)感染系統(tǒng))都敲除后，用該細(xì)菌K-12 MG1655 ΔRM為宿主，從不同環(huán)境中分離到61個(gè)新噬菌體。用O抗原缺失的細(xì)菌可避免篩選到以O(shè)抗原為受體的噬菌體。因此，此次分離的新噬菌體的受體均為不同的細(xì)菌表面蛋白，且研究人員回補(bǔ)一種限制修飾系統(tǒng)后，細(xì)菌將對(duì)部分噬菌體產(chǎn)生抵抗，導(dǎo)致噬斑無(wú)法形成。該研究說(shuō)明，細(xì)菌攜帶的各種抵抗機(jī)制會(huì)限制分離到噬菌體的概率，而用缺乏該系統(tǒng)的菌株則有望分離到新的噬菌體。

宏基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)ssDNA噬菌體大量存在于腸道等環(huán)境中，但是分離鑒定的ssDNA噬菌體相對(duì)較少。少數(shù)裂解性的ssDNA噬菌體可利用噬斑實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分離鑒定[24]。但部分ssDNA噬菌體為溶原性噬菌體，且攜帶有超感染排斥機(jī)制(superinfection exclusion)，這些噬菌體整合在細(xì)菌基因組中，導(dǎo)致這些細(xì)菌對(duì)其他ssDNA噬菌體形成抵抗，難以形成噬斑。因此，ssDNA噬菌體有時(shí)難以用噬斑實(shí)驗(yàn)分離[25]。

3.3 模擬噬菌體培養(yǎng)的新條件

細(xì)菌-噬菌體相互作用非常復(fù)雜，需要特定的培養(yǎng)條件，因此根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，盡量模擬原始生態(tài)環(huán)境中的條件，更容易在實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)造適合目標(biāo)噬菌體繁殖的環(huán)境。如，腸道細(xì)菌大多為厭氧和微需氧細(xì)菌，且大部分腸道細(xì)菌難以培養(yǎng)。因此，Santiago-Rodriguez等[26]建立了糞便恒溫培養(yǎng)系統(tǒng)，利用改進(jìn)的Infors Multifors系統(tǒng)模擬人類遠(yuǎn)端結(jié)腸環(huán)境以支持病毒組的復(fù)制，在24 d的5個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)檢查了培養(yǎng)的噬菌體群落，發(fā)現(xiàn)它們具有高度的個(gè)體特異性，且與原始糞便樣本中的噬菌體群落高度相似，說(shuō)明該方法可以用于支持噬菌體群落的繁殖。

對(duì)于難以在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)的細(xì)菌，需要先優(yōu)化培養(yǎng)方法來(lái)培養(yǎng)目標(biāo)細(xì)菌。如高通量測(cè)序技術(shù)證實(shí)SAR11是淡水中較為豐富的一種異養(yǎng)細(xì)菌，但是一直無(wú)法培養(yǎng)。研究人員將水樣稀釋到每個(gè)孔只含有1個(gè)細(xì)菌，然后在23℃培養(yǎng)30 d后，終于鑒定出了一些SAR11細(xì)菌[27]。其生長(zhǎng)非常緩慢，需要12 h才能繁殖一代，因此，較難分離培養(yǎng)。而分離到該細(xì)菌之后，研究人員就發(fā)現(xiàn)其攜帶的前噬菌體NP1。進(jìn)而發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)充足時(shí)，約2.3%的細(xì)菌會(huì)被NP1裂解，而在碳源缺乏的培養(yǎng)條件下，30.6%的細(xì)菌會(huì)被其裂解，揭示了噬菌體在海洋細(xì)菌生態(tài)學(xué)中的重要作用[28]。

3.4 選擇最佳的噬菌體鑒定方法

如果確定某一噬菌體在目標(biāo)細(xì)菌中可以繁殖，但是又無(wú)法形成噬斑時(shí)，可采用其他手段來(lái)鑒定。例如，宏基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)腸道中有大量的噬菌體，其中crAss類噬菌體是最知名的腸道噬菌體之一，超過(guò)50%的人類腸道中都有該噬菌體，且預(yù)測(cè)其宿主為擬桿菌。但是，用不同的擬桿菌為宿主分離crAss001，發(fā)現(xiàn)均沒(méi)有噬斑。最后，Colin Hill團(tuán)隊(duì)[29]就用宏基因組測(cè)序來(lái)檢測(cè)crAss001是否能在對(duì)應(yīng)細(xì)菌樣本中進(jìn)行繁殖。研究人員首先收集利用宏基因組技術(shù)鑒定了含有crAss001的樣本，然后將其上清與54個(gè)腸道主要的細(xì)菌菌株分別混合，用宏基因組技術(shù)檢測(cè)混合培養(yǎng)后的上清中是否有crAss001的基因組序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bacteroidales intestinalis919/174菌株可以支持crAss001的復(fù)制，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)crAss001可以在該菌株中形成噬斑。但是crAss001的宿主特異性非常高，另外14個(gè)來(lái)自6個(gè)不同種的擬桿菌菌株則不能被crAss001感染，無(wú)法形成噬斑[29]。該研究說(shuō)明，在對(duì)未知宿主的噬菌體進(jìn)行分離時(shí)，可先用大量菌株和測(cè)序技術(shù)，確定該噬菌體能否復(fù)制，再去進(jìn)一步精確尋找其宿主。

隨后，Colin Hill團(tuán)隊(duì)[30]則繼續(xù)嘗試使用噬斑實(shí)驗(yàn)分離其他crAss類噬菌體，但未成功。于是，對(duì)糞便樣本進(jìn)行厭氧培養(yǎng)后，同時(shí)加入萬(wàn)古霉素和卡那霉素，抑制革蘭陽(yáng)性和兼性厭氧細(xì)菌的生長(zhǎng)，并有利于嚴(yán)格厭氧的革蘭陰性擬桿菌生長(zhǎng)。然后，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行宏基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)crAss類噬菌體的比例在增加。同時(shí)，將富含crAss類噬菌體的糞便樣品進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)菌落形態(tài)選擇了48個(gè)菌落，進(jìn)行16S rRNA基因片段的測(cè)序后，發(fā)現(xiàn)48個(gè)菌落分別屬于6個(gè)菌種。將富含crAss噬菌體的上清分別加入到 48個(gè)菌株后，再用qPCR檢測(cè)單個(gè)菌株中crAss類噬菌體是否增加，最終從B.xylanisolνensAPCS1/XY菌株中鑒定到ΦcrAss002噬菌體的繁殖。但是，ΦcrAss002不會(huì)在敏感細(xì)菌中形成噬斑，液體培養(yǎng)時(shí)也不會(huì)導(dǎo)致菌液裂解澄清，說(shuō)明ΦcrAss002和類桿菌可以在適宜環(huán)境中共存，而不會(huì)產(chǎn)生劇烈的篩選而導(dǎo)致“此消彼長(zhǎng)”[30]。

此外，還可以采用不同的病毒基因組抽提方法，來(lái)鑒定噬菌體的存在。與成千上萬(wàn)的已經(jīng)完成測(cè)序的雙鏈DNA噬菌體相比，目前只有8個(gè)雙鏈RNA噬菌體被測(cè)序[31]。有趣的是，雙鏈RNA病毒在真菌中非常常見(jiàn)，通常具有共生或互惠的生活方式，不導(dǎo)致真菌的死亡[32]。因此，使用噬斑實(shí)驗(yàn)可能無(wú)法分離到這種非裂解生活周期的噬菌體。我們應(yīng)用分離真菌病毒的方法來(lái)鑒定細(xì)菌中的雙鏈RNA噬菌體，成功地從一株微枝桿菌中分離出一種新的雙鏈RNA噬菌體phiNY[33]。phiNY的基因組由3個(gè)雙鏈RNA片段組成，其基因組序列與任何其他噬菌體都沒(méi)有核苷酸序列相似性。且感染phiNY的菌株比未感染噬菌體的菌株生長(zhǎng)得更快，表現(xiàn)為一種共生寄生的生活方式。因此，這項(xiàng)研究不僅揭示了一種新的互惠寄生雙鏈RNA噬菌體，也提示：其他病毒分離方法對(duì)于鑒定具有其他生活方式的噬菌體是有價(jià)值的。

4 溶原性噬菌體的鑒定與培養(yǎng)方法

溶原性噬菌體是一類可以整合在細(xì)菌基因組中的噬菌體，具有裂解和溶原兩種周期[34]。有些溶原性噬菌體可形成模糊的噬斑，有些溶原性噬菌體則無(wú)法形成噬斑。這是由于不同噬菌體進(jìn)入裂解和溶原周期的調(diào)控機(jī)制不一，不僅涉及噬菌體自身的調(diào)控機(jī)制，如抑制蛋白CI對(duì)噬菌體的抑制，還涉及群體感應(yīng)系統(tǒng)、SOS系統(tǒng)、H-NS蛋白等系統(tǒng)對(duì)溶原周期的調(diào)控[34-35]。溶原性噬菌體的鑒定方法包括以下3種。

4.1 利用噬斑實(shí)驗(yàn)鑒定溶源性噬菌體

部分溶原性噬菌體可以形成模糊噬斑，這是比較理想的研究對(duì)象。如部分溶原性噬菌體可在傷寒沙門菌中形成噬斑，可用噬斑實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)[36]。但是，溶原性噬菌體要形成噬斑，不僅面臨裂解性噬菌體所面臨的所有問(wèn)題，還涉及溶原-裂解周期的調(diào)控機(jī)制[37]。因此，大部分溶原性噬菌體不能形成噬斑。但是，如果敲除部分抵抗機(jī)制相關(guān)基因，則可以使得溶原性噬菌體形成噬斑。例如，傷寒沙門菌攜帶的BstA是一種流產(chǎn)感染系統(tǒng)蛋白，能抵抗溶源性噬菌體的感染。而敲除BstA的菌株則可被部分溶源性噬菌體感染，形成模糊的噬斑，便于觀察和研究[36]。

4.2 誘導(dǎo)溶源性噬菌體進(jìn)入裂解周期并鑒定

部分溶原性噬菌體很穩(wěn)定地整合于細(xì)菌基因組，不容易進(jìn)入裂解周期，無(wú)法形成噬斑。可用絲裂霉素C、紫外線等方法，誘導(dǎo)前噬菌體進(jìn)入裂解周期，形成溶原性噬菌體顆粒[38]。如果誘導(dǎo)成功，可使得菌液變澄清，或者顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)菌大量裂解，則高度提示有溶原性噬菌體產(chǎn)生。進(jìn)一步抽提病毒顆粒的基因組，進(jìn)行測(cè)序鑒定，或者進(jìn)行電鏡觀察。

4.3 溶源性噬菌體的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與鑒定

從細(xì)菌基因組和宏基因組序列中預(yù)測(cè)溶原性噬菌體，再有目標(biāo)地進(jìn)行分離鑒定，可提高分離鑒定成功率，給溶原性噬菌體的研究提供了極大的便利。溶原性噬菌體是口腔和腸道病毒組的主要成員，溶原性噬菌體在口腔、腸道中的作用受到高度關(guān)注[39]。因此，基于宏基因組技術(shù)的噬菌體組學(xué)方法可幫助判斷所培養(yǎng)的樣本中是否存在目標(biāo)噬菌體。如，MARVEL是基于隨機(jī)森林機(jī)器學(xué)習(xí)方法來(lái)預(yù)測(cè)宏基因組中的噬菌體序列[40]。另一項(xiàng)研究對(duì)16種宏基因組組裝方法在噬菌體組研究中的作用進(jìn)行了比較[41]，發(fā)現(xiàn)不同軟件的組裝性能差異很大，SPAdes(meta)軟件的表現(xiàn)較好。但是，病毒組數(shù)據(jù)分析還有很多挑戰(zhàn)，如低讀取覆蓋率、基因組重復(fù)導(dǎo)致組裝的基因組回收率低、碎片化程度高、閾值設(shè)定等，從病毒組數(shù)據(jù)中得出結(jié)論時(shí)必須謹(jǐn)慎考慮這些因素。

此外，根據(jù)單個(gè)細(xì)菌的序列可更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)前噬菌體，如Phage_Finder[42]、PHASTER[43]和 Prophage Hunter[44]。PHASTER是一個(gè)基于網(wǎng)絡(luò)的服務(wù)器，用于快速識(shí)別和注釋細(xì)菌基因組和質(zhì)粒中的原噬菌體序列[43]。Prophage Hunter不僅可以系統(tǒng)地定位細(xì)菌基因組內(nèi)的原噬菌體區(qū)域，并預(yù)測(cè)原噬菌體的活性，它還確定了與目標(biāo)原噬菌體在系統(tǒng)進(jìn)化上最相關(guān)的噬菌體，并在整個(gè)噬菌體基因組中注釋蛋白質(zhì)的功能[44]。根據(jù)預(yù)測(cè)的前噬菌體及其激活后的狀態(tài)，就可以設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，利用PCR或電鏡等方式對(duì)激活的前噬菌體進(jìn)行鑒定[45]。

例如，Cornuault等[46]先利用PHASTER工具，從15株普氏糞桿菌(Faecalibacterium prausnitzii)基因組中預(yù)測(cè)了18個(gè)前噬菌體，用測(cè)序的方法發(fā)現(xiàn)前噬菌體Lagaffe和Mushu可以被激活，其基因組拷貝數(shù)分別為宿主菌A2-165的8倍和16倍，然后用電鏡觀察到Mushu噬菌體的形態(tài)，但是這些噬菌體不會(huì)形成噬斑，無(wú)法用噬斑實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定。

以上程序主要依賴已知噬菌體的內(nèi)置驗(yàn)證數(shù)據(jù)集進(jìn)行序列相似性搜索，以識(shí)別與噬菌體相關(guān)的基因富集區(qū)域，預(yù)測(cè)出的前噬菌體很多是不能進(jìn)入裂解周期的。最近，王曉雪團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一個(gè)預(yù)測(cè)前噬菌體的軟件Prophage Tracer[47]，該程序是基于單個(gè)細(xì)菌基因組測(cè)序原始數(shù)據(jù)，來(lái)預(yù)測(cè)是否有溶原性噬菌體的軟件，而不是基于噬菌體基因相似性搜索。Prophage Tracer使用重疊拆分技術(shù)讀取包含細(xì)菌和噬菌體的整合序列，代表原噬菌體切除信號(hào)的位點(diǎn)。如果前噬菌體被激活，測(cè)序時(shí)就會(huì)出現(xiàn)上述信號(hào)，軟件可檢測(cè)到激活的前噬菌體特征，并可預(yù)測(cè)前噬菌體的精確整合位點(diǎn)(表1)。

表1 噬菌體分離鑒定方法總結(jié)Tab.1 The methods to isolate bacteriophag

5 展望

隨著微生物組[48]、基因編輯工具[49]和噬菌體治療[50-51]等領(lǐng)域的飛速發(fā)展，噬菌體研究也進(jìn)入了復(fù)興時(shí)代。但是，目前大多數(shù)噬菌體研究對(duì)象還比較局限，多為模式細(xì)菌、常見(jiàn)病原體以及少數(shù)生態(tài)環(huán)境中的噬菌體，還有大量的新型噬菌體有待分離鑒定，而這些噬菌體中可能蘊(yùn)含著全新的生物學(xué)現(xiàn)象，或存在新的分子生物學(xué)工具，是進(jìn)一步拓展噬菌體研究的基石。

噬菌體是細(xì)菌的病毒，而目前自然界還有大量的細(xì)菌無(wú)法分離培養(yǎng)[52-53]，因此，噬菌體研究人員也應(yīng)及時(shí)關(guān)注細(xì)菌分離培養(yǎng)的新方法，利用新分離的細(xì)菌去分離新的噬菌體，則有望發(fā)現(xiàn)全新的生物學(xué)規(guī)律[28]。

在無(wú)法分離到所需的噬菌體時(shí)，要仔細(xì)思考和創(chuàng)新噬菌體的分離方法，可考慮更換樣本、宿主菌和培養(yǎng)方法，使得噬菌體可在實(shí)驗(yàn)室模擬的環(huán)境下繁殖，而噬菌體最終要裂解細(xì)菌并釋放噬菌體顆粒。因此，可用噬斑實(shí)驗(yàn)、qPCR、熒光染色、宏基因組測(cè)序、電鏡等多種鑒定手段證實(shí)噬菌體的存在，再進(jìn)一步對(duì)噬菌體進(jìn)行鑒定，為開(kāi)拓新的研究領(lǐng)域奠定基礎(chǔ)。