LncRNA HOXC13-AS靶向miR-634對子宮內膜癌細胞生物學行為的影響

張英 劉宇 晁利娜

(新鄉市中心醫院產科，河南 新鄉 453000)

子宮內膜癌是婦科疾病中常見惡性腫瘤之一，其主要是一種發生于子宮內膜的上皮性惡性腫瘤，關于其發病機制尚未闡明，絕大部分子宮內膜癌患者有較差且死亡率較高〔1〕。越來越多的實驗表明，異常表達的長鏈非編碼(Lnc)RNA可以作為癌癥診斷的生物標志物和潛在的治療靶點， 此外，部分LncRNA已被證實可參與調控子宮內膜癌細胞增殖、分化、遷移等生物學過程〔2，3〕。研究表明長鏈非編碼RNA HOXC13-AS(LncRNA HOXC13-AS)在肝癌組織中上調表達，并可參與肝癌發生發展過程〔4〕。HOXC13-AS在乳腺癌組織中高表達，上調乳腺癌細胞中的HOXC13-AS含量可加速癌細胞的增殖〔5〕。然而，關于子宮內膜癌中HOXC13-AS的表達功能和機制尚未可知。通過starBase預測發現微小RNA-634(miR-634)含有HOXC13-AS的互補序列。miR-634在胰腺癌中表達下調，過表達miR-634抑制胰腺癌細胞增殖、遷移及侵襲，及誘導凋亡〔6〕。此外，miR-634在宮頸癌細胞中過表達可破壞癌細胞增殖、侵襲及遷移〔7〕。但是，HOXC13-AS是否通過調節miR-634在子宮內膜癌發揮作用尚未完全闡明。因此，本實驗探討HOXC13-AS與miR-634在子宮內膜癌中的具體作用及其機制，進一步探究HOXC13-AS與miR-634之間的調控關系及其對子宮內膜癌細胞的生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 美國ATCC細胞庫提供子宮內膜癌細胞株Ishikawa；美國Gibco公司提供杜氏改良培養基(DMEM)、胰蛋白酶、胎牛血清；美國Thermo Fisher公司提供Lipofectamine2000；廣州銳博生物科技提供亂序無意義陰性對照序列(si-NC)、HOXC13-AS小干擾RNA(si-HOXC13-AS)、陰性對照(miR-NC)、miR-634 模擬物；上海吉瑪制提供miR-634特異性寡核苷酸抑制劑 (anti-miR-634)及其陰性對照；pcDNA3.1購自上海索寶生物；噻唑藍(MTT)購自上海澤葉生物；美國BD公司提供膜聯蛋白V異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)試劑、Matrigel基質膠；美國Corning公司提供Transwell小室；雙熒光素酶報告載體及檢測試劑盒購自美國Promega公司；山羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司，一抗均購自美國Cell Signaling Technology公司。組織標本：收集20對于2017年3月至2018年5月新鄉市中心醫院進行手術治療的子宮內膜癌患者的癌組織及癌旁組織，年齡46～60歲，并置于-80 ℃保存。患者均經病理確診。本研究已經過醫院倫理委員會批準，所有患者簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1細胞轉染及分組 取生長狀態良好的Ishikawa細胞參照Lipofectamine2000進行轉染，按照隨機數字表法隨機分為si-NC組(si-NC轉染至Ishikawa細胞)、si-HOXC13-AS組(si-HOXC13-AS轉染至Ishikawa細胞)、miR-NC組(miR-NC轉染至Ishikawa細胞)、miR-634組(miR-634 mimics轉染至Ishikawa細胞)、si-HOXC13-AS+anti-miR-NC組(si-HOXC13-AS與anti-miR-NC共轉染至Ishikawa細胞)、si-HOXC13-AS+anti-miR-634組(si-HOXC13-AS與anti-miR-634共轉染至Ishikawa細胞)。

1.2.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR) 采用Trizol法提取組織及細胞總RNAs，根據反轉錄試劑盒說明書合成cDNAs， 隨后最后采用qRT-PCR檢測 HOXC13-AS(內參GAPDH)和miR-634(內參U6)的相對表達量。

1.2.3MTT 將對數期生長的Ishikawa細胞接種到96孔板中。 將細胞在 37℃培養24、48、72 h后每孔加入20 μl MTT溶液孵育4 h。棄上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)室溫孵育1 h ，然后在490 nm下測量每個孔中的吸光度值。

1.2.4流式細胞術 將各組Ishikawa細胞重懸于500 μl 1×結合緩沖液中，隨后與5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI室溫避光孵育10 min， 最后通過流式細胞術對樣品凋亡進行分析。

1.2.5Transwell 將各組對數期生長的Ishikawa細胞重懸于不含血清的DMEM培養液中制備成單細胞懸液。取200 μl細胞懸液置于Transwell 室上室中〔Matrigel基質膠涂層(40 μl/孔)用于侵襲檢測和未涂層用于遷移檢測〕， 隨后將600 μl含有10%胎牛血清的培養基添加到下室中。 培養24 h后，PBS洗滌，通過膜的細胞用0.1%結晶紫染液染色10 min，然后顯微鏡下觀察計數。

1.2.6雙熒光素酶報告實驗 starBase預測顯示HOXC13-AS的序列中含有與miR-634互補的核苷酸序列。將含有miR-634結合位點或位點突變序列的HOXC13-AS片段克隆到熒光素酶載體中構建野生型(WT)或突變型(MUT)熒光素酶報告載體(WT/MUT-HOXC13-AS)。隨后分別將上述重組質粒與miR-NC、miR-634 mimics共轉染至Ishikawa細胞，24 h后檢測熒光素酶活性。

1.2.7Western印跡檢測 采用蛋白裂解液(1 ml RIPA、1% PMSF、0.1% 抑肽酶)提取細胞總蛋白。BCA法檢測蛋白濃度后，30 μg蛋白通過10%十二烷基硫酸鈉聚乙酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，并將蛋白質轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h后，該膜在4℃條件下與一抗(1∶1 000)孵育12 h，隨后在室溫條件下與二抗(1∶5 000)孵育1 h。采用電化學發光(ECL)試劑盒檢測蛋白信號，應用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3統計學方法 采用SPSS21.0統計學軟件進行t檢驗或單因素方差分析。

2 結 果

2.1LncRNA HOXC13-AS和miR-634在子宮內膜癌組織中表達 HOXC13-AS在子宮內膜癌組織中表達顯著高于癌旁組織(P<0.05)，而miR-634的表達顯著低于癌旁組織(P<0.05)，見表1。

表1 LncRNA HOXC13-AS和miR-634在子宮內膜癌組織中的表達

2.2抑制HOXC13-AS表達對子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖、凋亡的影響 相對于si-NC組，si-HOXC13-AS組HOXC13-AS表達水平顯著降低(P<0.05)。敲低HOXC13-AS降低Ishikawa細胞活力和促進細胞凋亡(P<0.05)，此外，下調Ishikawa細胞中HOXC13-AS表達抑制細胞周期蛋白(Cyclin)D1和B細胞淋巴瘤(Bcl)-2的蛋白表達并促進p21和Bcl-2相關X蛋白(Bax)的蛋白含量 (P<0.05)，見表2、圖1。

表2 抑制HOXC13-AS表達對子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖、凋亡的影響

2.3抑制HOXC13-AS表達對子宮內膜癌Ishikawa細胞遷移、侵襲的影響 與si-NC組比較，si-HOXC13-AS組Ishikawa細胞遷移與侵襲能力降低并伴隨著基質金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9表達含量的下降(P<0.05)，見圖2、表3。

2.4miR-634過表達對子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響 相較于miR-NC轉染，miR-634 mimic轉染顯著升高Ishikawa細胞中miR-634的含量(P<0.05)；功能實驗表達，miR-634過表達抑制細胞活力，遷移和侵襲，促進細胞凋亡 (P<0.05)；此外，miR-634 mimic轉染升高p21和Bax蛋白表達，降低CyclinD1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表達(P<0.05)，見表4、圖3、表5、圖4。

圖1 抑制HOXC13-AS表達對子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖、凋亡的影響

圖2 遷移侵襲相關蛋白表達及抑制HOXC13-AS表達對子宮內膜癌Ishikawa細胞遷移、侵襲的影響(結晶紫染色，×200)

表3 抑制HOXC13-AS表達對子宮內膜癌Ishikawa細胞遷移、侵襲的影響

2.5LncRNA HOXC13-AS靶向調控miR-634的表達 HOXC13-AS與 miR-634互補序列見圖5。與miR-NC、WT-HOXC13-AS共轉染組比較，miR-634 mimics、WT-HOXC13-AS共轉染組熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；miR-NC、MUT-HOXC13-AS共轉染組與miR-634 mimics、MUT-HOXC13-AS共轉染組熒光素酶活性比較差異無統計學意義(P>0.05)。此外，HOXC13-AS過表達抑制細胞中miR-634的表達含量，而HOXC13-AS下調促進細胞中miR-634的表達(P<0.05)，見表6。

表4 miR-634過表達對子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響

圖3 細胞凋亡流式圖及miR-634過表達對子宮內膜癌Ishikawa細胞凋亡、遷移、侵襲的影響(結晶紫染色，×200)

表5 miR-634過表達對子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲相關蛋白表達的影響

圖4 兩組蛋白電泳

2.6干擾miR-634表達逆轉抑制HOXC13-AS對子宮內膜癌Ishikawa細胞的作用 HOXC13-AS沉默上調了miR-634表達，但是miR-634低表達減弱了此影響。同樣地，miR-634低表達抑制了si-HOXC13-AS對Ishikawa細胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用和對凋亡的促進作用。HOXC13-AS沉默在Ishikawa細胞中抑制了CyclinD1,Bcl-2,MMP-2和MMP-9的蛋白表達但促進了p21和Bax的蛋白表達；然而，si-HOXC13-AS和anti-miR-634的共轉染減弱了HOXC13-AS沉默引起的這些效應。見表6、表7、圖6和圖7。

圖5 HOXC13-AS與miR-634的互補序列互補的核苷酸序列

表6 干擾miR-634表達逆轉了抑制HOXC13-AS對子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的作用

表7 干擾miR-634表達逆轉了抑制HOXC13-AS對子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲相關蛋白表達的作用

圖6 細胞凋亡流式圖、干擾miR-634表達逆轉了抑制HOXC13-AS對子宮內膜癌Ishikawa細胞凋亡、遷移、侵襲的作用(結晶紫染色，×200)

1～4：si-NC、si-HOXC13-AS、si-HOXC13-AS+anti-miR-NC、si-HOXC13-AS+anti-miR-634圖7 4組蛋白電泳

3 討 論

子宮內膜癌早期癥狀隱匿導致早期診斷效率降低，患者術后易復發且化療敏感性降低導致子宮內膜癌患者死亡率逐年升高〔8〕。因而基于子宮內膜癌細胞的生物學特性尋找新的治療靶點有助于提高子宮內膜癌診斷及治療水平。有研究表明LncRNA在子宮內膜膜中發揮重要調控作用， LncRNA可通過充當miRNA競爭性內源RNA在子宮內膜癌的病理進展中發揮作用〔9，10〕。因而深入探究LncRNA-miRNA調控機制可為子宮內膜癌早期診斷及預后判斷提供新的生物標志物，并可為子宮內膜癌治療提供新的潛在靶點。

HOXC13-AS可促進神經膠質瘤的遷移及侵襲〔11〕。研究表明，HOXC13-AS通過調節miR-383-3p/HMGA2分子軸促進鼻咽癌細胞增殖及侵襲〔12〕。相關報道指出HOXC13-AS高表達與膽管癌患者預后不良有關〔13〕。但HOXC13-AS在子宮內膜癌中的表達尚未可知。本研究結果提示，HOXC13-AS的表達量升高可能促進子宮內膜癌的發生。抑制HOXC13-AS降低子宮內膜癌細胞活力顯著降低，提示HOXC13-AS可能通過促進子宮內膜癌細胞增殖而參與其發生過程。研究表明，CyclinD1在多種腫瘤中均呈高表達，并可通過正向調控細胞周期促進細胞生長，p21可抑制CyclinD1與細胞周期依賴蛋白激酶的結合從而誘導細胞周期阻滯于G0/G1期，抑制細胞生長〔14〕。本研究發現，敲除HOXC13-AS可抑制子宮內膜癌細胞中CyclinD1的表達但是升高p21的表達。Bcl-2蛋白家族可參與細胞凋亡過程，其中Bcl-2屬于抗凋亡蛋白，Bax屬于促凋亡蛋白〔15〕。本研究進一步發現，HOXC13-AS敲除后，子宮內膜癌細胞凋亡率顯著升高，同時細胞中Bax的表達水平顯著升高而Bcl-2的表達水平明顯減低。MMP-2和MMP-9是一種含鋅的金屬蛋白酶，具有廣泛的底物特異性，可參與細胞外基質降解從而促進細胞轉移，已有研究發現 MMP-2和MMP-9可參與子宮內膜癌浸潤及轉移過程〔16〕。本研究發現，下調HOXC13-AS伴隨著細胞遷移侵襲的抑制及MMP-2和MMP-9表達水平的顯著下降。綜上，抑制HOXC13-AS可能通過下調相關蛋白的表達從而破壞子宮內膜癌細胞的生長和轉移。

在舌鱗狀細胞癌中miR-634呈低表達，上調miR-634的表達可抑制circ_0001742的促癌作用〔17〕。研究表明，miR-634可抑制胃癌細胞增殖、遷移及侵襲〔18〕。LncRNA DANCR通過充當miR-634的海綿分子從而促進神經膠質瘤的發生〔19〕。相關報道指出miR-634通過靶向抑制Rab1A和DHX33的表達抑制肝細胞癌的發展〔20〕。本研究提示，miR-634可能參與子宮內膜癌發生發展過程。隨后，本研究證明miR-634是HOXC13-AS的直接靶標，HOXC13-AS負向調節miR-634在子宮內膜癌細胞中的表達。 重要的是，通過一系列回復實驗，證明抑制miR-634可以逆轉HOXC13-AS在子宮內膜癌細胞中促凋亡，抗遷移和抗侵襲的能力。

綜上，HOXC13-AS在子宮內膜癌中呈高表達，miR-634在子宮內膜癌中呈低表達，HOXC13-AS通過靶向抑制miR-634表達從而促進子宮內膜癌細胞增殖、遷移及侵襲，抑制細胞凋亡，可為子宮內膜癌診斷提供新的分子標志物，并可為子宮內膜癌的治療提供潛在靶點。