LINC00339在急性心肌梗死大鼠中表達及其對心肌細胞凋亡、炎癥反應和Rock1、NLRP3表達的影響

陳孝良 黃秀峰 張文榮 吳奇志

(廈門大學附屬 1第一醫院思明分院綜合內科 ，福建 廈門 361000；中山醫院 2內分泌科；3嘉蓮社區服務中心)

急性心肌梗死(AMI)是因動脈堵塞導致心肌長時間缺血而引起壞死的一種心血管疾病，具有發病急和病死率高等特點〔1〕。目前，臨床常用的介入治療和藥物溶栓等手段雖然使患者死亡率有所降低，但對部分患者的治療效果并不理想〔2〕，故尋找精準有效的治療方案一直是近年來研究的熱點。研究表明，在AMI患者中存在異常表達的長鏈非編碼RNA(lncRNA)，而這些lncRNAs可能通過影響心肌細胞凋亡和炎癥反應等在AMI發生發展過程中發揮著重要調控作用〔3～5〕。近年來，有學者發現，lncRNAs家族成員LINC00339(又稱HSPC157)在阿霉素誘導的心肌細胞凋亡過程中發揮著重要的促進作用〔6〕；然而，LINC00339是否通過影響心肌細胞功能參與AMI發病機制并不清楚。本研究探討LINC00339在AMI大鼠中的表達情況其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及主要試劑 體重在(240±20)g內的48只清潔級SD大鼠購于北京科宇動物養殖中心，許可證號：SCXK(京)2018-0010；攜帶陰性對照(NC)及siRNA-LINC00339的慢病毒由上海科維創生物科技有限公司包裝完成；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色液、總RNA提取試劑盒、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3活性測定試劑盒(貨號：G3004、R1200、BC3830)購于北京索萊寶生物科技有限公司；實時熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒(貨號：M107R1)購于南京歐凱生物公司，原位末端轉移酶標記技術(TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒和大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6和IL-1β酶聯免疫吸附試驗測定(ELISA)試劑盒(貨號：E607172、D731012、D731010、D731007)購于上海生工生物工程股份有限公司；兔抗大鼠B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體和Bcl-2相關X蛋白(Bax)、Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶1(Rock1)、含NLR家族Pyrin域蛋白(NLRP)3單克隆抗體(貨號：ab194583、ab37168、ab32503、ab134181、ab263899)購于中國Abcam。

1.2AMI大鼠模型的構建與實驗分組 SD大鼠在溫度為(25±2)℃、相對濕度為(60±10)%、光照周期12 h/12 h環境下飼養，均進行自由攝食飲水。在適應性飼養1 w后，在48只大鼠中隨機選取30只，并采用冠狀動脈左前降支結扎方法構建AMI模型〔7〕：大鼠麻醉后，在頸部做切口連接呼吸機，開胸暴露心臟后，對冠狀動脈左前降支進行結扎。如果觀察到心電圖ST段抬高且心率減慢、左心室發白時表明AMI模型構建成功。將建模成功的27只大鼠隨機分為模型組、NC組和siLINC00339組，每組9只；另外，將只進行開胸但不對冠狀動脈左前降支進行結扎的9只SD大鼠作為假手術組，將不進行任何處理的9只SD大鼠作為對照組。其中，將攜帶陰性對照NC及siRNA-LINC00339的慢病毒于術后注射至NC組和siLINC00339組大鼠心肌內，并將等量生理鹽水注射到模型組和假手術組大鼠心肌內。術后72 h處死大鼠取心肌組織，保存在-80℃下備用。

1.3心臟彩超和TTC染色法分別檢測大鼠心功能指標與心肌梗死面積 ①心功能指標：在各組大鼠處死前，以10%水合氯醛腹腔進行麻醉后，采用心臟彩超檢測大鼠心功能指標；②心肌梗死面積：取凍存的位于心尖至結扎點之間的心肌組織，行5 μm厚切片；將切片置于TTC染色液中染色15 min后，采用Image-Pro Plus7.0版圖像分析軟件觀察分析。其中，被染成紅色的部分為正常心肌區，被染成白色的部分為心肌梗死區域，而心肌梗死面積以白色區域與切面總面積的百分比表示。

1.4RT-qPCR檢測心肌組織中LINC00339、Bcl-2、Bax、Rock1、NLRP3 mRNA表達 參照總RNA提取試劑盒提取結扎線以下部分心肌組織總RNA，檢測RNA濃度后，將其進行逆轉錄；以逆轉錄產物cDNA為模板，參照RT-qPCR試劑盒說明書以GAPDH為內參運用2-△△Ct法檢測并計算各組大鼠心肌組織中LINC00339、Bcl-2、Bax、Rock1、NLRP3 mRNA表達水平。其中，①反應條件：94℃ 6 min，94℃ 10 s、55～60℃ 30 s、72℃ 30 s，該過程共循環38次；②由上海生工生物工程有限公司合成的PCR引物序列：LINC00339上游：5′-GGTTGACGAAGTCTGGAACG-3′，下游：5′-GCCCATCATTTCATTGGGTA-3′；Bcl-2 上游：5′-CCTGTGGATGACTGAGTACCTG-3′，下游：5′-AGCCAGGAGAAATCAAACAGAGG-3′；Bax上游：5′-AGGATGCGTCCACCAAGAAGCT-3′，下游：5′-TCCGTGTCCACGTCAGCAATCA-3′；Rock1上游：5′-CACGCCTAACTGACAAGCACCA-3′，下游：5′-CAGGTCAACATCTAGCATGGAAC-3′；NLRP3上游：5′-TCACAACTCGCCCAAGGAGGAA-3′，下游：5′-AAGAGACCACGGCAGAAGCTAG-3′；GAPDH上游：5′-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，下游：5′-CCATGTAGTTGAGGTCAATGAAG-3′。

1.5TUNEL法檢測心肌凋亡指數 取結扎線以下部分心肌組織，經石蠟包埋行5 μm切片，每組切3片；使用磷酸緩沖液洗滌7 min×3次，Triton X細胞通透液通透10 min并漂洗后，加入TUNEL工作液室溫避光反應1 h；再次洗滌后，以4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色15 min；洗去染液后，200倍熒光顯微鏡下觀察各組心肌細胞凋亡情況；其中，被染成綠色的細胞為凋亡細胞，以凋亡細胞與總細胞數的百分比表示各組心肌凋亡指數。

1.6比色法和ELISA分別檢測心肌組織中Caspase-3活性與TNF-α、IL-6、IL-1β含量 取結扎線以下部分心肌組織，參照Caspase-3活性測定試劑盒和TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA試劑盒說明書分別檢測各組大鼠心肌組織中Caspase-3活性和TNF-α、IL-6、IL-1β含量。

1.7Western印跡檢測心肌組織中Bcl-2、Bax、Rock1、NLRP3蛋白表達 取結扎線以下部分心肌組織，加入RIPA細胞裂解液提取組織總蛋白；將定量后的蛋白樣品行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，采用半干法將蛋白樣品轉至聚偏氟乙烯膜上；經含5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h后，加入Bcl-2(1∶2 000)、Bax(1∶2 000)、Rock1(1∶1 000)、NLRP3(1∶1 000)和GAPDH(1∶2 000)特異性抗體4℃下孵育過夜；次日，以二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h后，加入發光劑暗室內顯影；將GAPDH作為內參，采用Quantity One軟件分析各組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax、Rock1和NLRP3蛋白表達水平。

1.8統計學分析 采用SPSS25.0軟件進行單因素方差分析及SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1LINC00339在AMI大鼠心肌組織中的表達及siRNA-LINC00339干預效果 與對照組LINC00339表達量(1.00±0.00)比較，假手術組心肌組織中LINC00339表達水平差異無統計學意義(0.96±0.07，P>0.05)；與假手術組比較，模型組心肌組織中LINC00339表達水平明顯升高(3.86±0.33，P<0.05)。與模型組比較，NC組心肌組織中LINC00339表達水平差異無統計學意義(3.78±0.26，P>0.05)；與NC組比較，siLINC00339組心肌組織中LINC00339表達水平明顯降低(1.15±0.07，P<0.05)。

2.2下調LINC00339表達對大鼠心功能的影響 與假手術組比較，模型組心功能指標左室長軸縮短分數、左室射血分數明顯降低，而左室舒張末期內徑、左室收縮末期內徑明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，NC組上述指標差異均無統計學意義(P>0.05)；與NC組比較，siLINC00339組左室長軸縮短分數、左室射血分數明顯升高，而左室舒張末期內徑、左室收縮末期內徑明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.3下調LINC00339表達對心肌梗死面積、凋亡指數和Caspase-3活性的影響 與假手術組比較，模型組心肌梗死面積、凋亡指數和Caspase-3活性均明顯升高(P<0.05)；NC組和模型組之間上述指標差異均無統計學意義(P>0.05)，但siLINC00339組心肌梗死面積、凋亡指數和Caspase-3活性較NC組均明顯降低(P<0.05)。見圖1和表2。

表1 各組心功能指標的比較

圖1 下調LINC00339表達對心肌梗死面積和凋亡的影響

2.4下調LINC00339表達對心肌組織中TNF-α、IL-6和IL-1β含量的影響 與假手術組比較，模型組心肌組織TNF-α、IL-6和IL-1β含量均明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，NC組心肌組織中TNF-α、IL-6和IL-1β含量差異均無統計學意義(P>0.05)；然而，siLINC00339組心肌組織中TNF-α、IL-6和IL-1β含量均低于NC組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表2 各組心肌梗死面積、凋亡指數和Caspase-3活性比較

2.5下調LINC00339表達對心肌組織中Bcl-2、Bax、Rock1、NLRP3 mRNA表達水平的影響 與假手術組比較，模型組心肌組織中Bcl-2 mRNA表達水平明顯降低，而Bax、Rock1和NLRP3 mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，NC組心肌組織中Bcl-2、Bax、Rock1和NLRP3 mRNA表達水平差異均無統計學意義(P>0.05)；與NC組比較，siLINC00339組心肌組織中Bcl-2 mRNA表達水平明顯升高，而Bax、Rock1和NLRP3 mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)。見表4。

表3 各組心肌組織中TNF-α、IL-6和IL-1β含量的比較

表4 各組心肌組織中Bcl-2、Bax、Rock1和NLRP3 mRNA及蛋白表達水平的比較

2.6下調LINC00339表達對心肌組織中Bcl-2、Bax、Rock1、NLRP3蛋白表達水平的影響 與假手術組比較，模型組心肌組織中Bcl-2蛋白表達水平明顯降低，而Bax、Rock1和NLRP3蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，NC組心肌組織中Bcl-2、Bax、Rock1和NLRP3蛋白表達水平差異均無統計學意義(P>0.05)；與NC組比較，siLINC00339組心肌組織中Bcl-2蛋白表達水平明顯升高，而Bax、Rock1和NLRP3蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。見表4和圖2。

圖2 Western印跡檢測Bcl-2、Bax、Rock1和NLRP3蛋白表達

3 討 論

LncRNAs是一類長度超過200個氨基酸的RNA，雖然不具有編碼蛋白的功能，但可在表觀遺傳水平、轉錄及轉錄后水平調控基因表達，在機體生長、發育和物質代謝等過程中發揮著重要作用。目前，關于LncRNAs的研究多集中在腫瘤方面，但LncRNAs在AMI等心血管疾病中的作用也逐漸引起關注〔8〕。LINC00339是lncRNAs家族成員，可通過調控細胞增殖和凋亡等參與多種疾病的發生發展。如：乳腺癌中異常高表達的LINC00339可通過調控miR-377-3p/HOXC6軸影響細胞周期促進腫瘤細胞增殖并抑制細胞凋亡〔9〕；在骨質疏松中，LINC00339表達下調可通過增加成骨細胞中CDC42的表達影響骨代謝〔10〕；在水草酸鈣誘導的腎小管損傷模型中LINC00339表達上調，并且LINC00339可通過調控miR-22-3p/NLRP3軸促進炎癥因子IL-1β和IL-18表達加重炎癥損傷促進腎小管上皮性上瞼下垂的發生發展〔11〕；然而，LINC00339在AMI發生發展中的作用并不清楚。

本研究在構建的AMI大鼠心肌組織中發現LINC00339表達顯著升高，提示LINC00339可能在AMI發生發展過程中發揮著重要作用。將攜帶陰性對照NC及siRNA-LINC00339的慢病毒注射至AMI大鼠心肌內成功下調LINC00339表達后發現，下調LINC00339表達可改善AMI大鼠心臟功能。大量研究表明，心肌細胞凋亡是心肌梗死和心力衰竭發生發展的重要機制〔12，13〕。本研究結果表明，下調LINC00339表達可抑制AMI大鼠心肌細胞凋亡，與Jing等〔6〕研究所得到的LINC00339低表達可通過miR-484抑制阿霉素誘導心肌細胞凋亡的結果相吻合。此外，在AMI發生后，心肌不僅會因缺氧、缺血而發生壞死，還可釋放細胞內物質促進炎癥反應的發生，可見炎癥反應也是AMI發病的重要機制之一〔14～16〕。本研究結果提示，LINC00339可能通過影響心肌凋亡和炎癥反應等參與AMI發生發展。

Rock1是一種Rho效應蛋白，也是Rho/Rock信號通路的關鍵分子之一，被Rho激活后可通過調控下游相關基因表達在細胞增殖、遷移和凋亡等過程中發揮著重要作用。在AMI發生后心肌組織中Rock1異常高表達〔17〕，且Rock1在心肌細胞凋亡過程中發揮著重要調控作用〔18〕。NLRP3是一種重要的炎癥小體，在機體固有免疫中發揮著重要作用。在AMI發生后心肌組織NLRP3表達上調，而抑制其表達可減弱心肌炎癥反應〔19〕。有研究指出，LINC00339可通過正向調控Rock1表達促進肝癌細胞增殖與遷移〔20〕，還可通過正向調控NLRP3表達促進腎小管炎癥損傷〔11〕。本研究進一步結果提示，LINC00339可能通過調控Rock1、NLRP3影響心肌細胞凋亡和炎癥反應，進而參與AMI發生發展。

綜上，本研究揭示LINC00339在AMI大鼠心肌組織中表達上調，下調其表達可能通過調控Rock1、NLRP3表達抑制心肌細胞凋亡和炎癥反應；然而，LINC00339是通過何種通路或基因來調控Rock1、NLRP3表達的還有待后續進一步探討。