miR-181a-5p對氧化應激誘導皮膚老化的促進作用及其機制

黃燕 楊艷清 萬睿 周進飛 張層層 劉睿 許其軍 張名 李慧娟

(1武漢市第三醫院整形外科；2襄陽市伊萊美醫療美容門診部美容皮膚科；3潛江市皮膚病防治院醫學美容科；4武漢市第三醫院皮膚科)

引起皮膚衰老的原因主要包括內在和外在兩方面的因素，內在因素在年齡達30歲左右時出現，這時細胞自我更新變慢及激素的產生引起皮膚上的變化；外在因素則是由于皮膚暴露于外部環境(尤其是紫外線輻射)，導致自由基的產生，自由基攻擊皮膚結構，破壞膠原蛋白和彈性纖維，從而導致皮膚衰老〔1〕。氧化應激在皮膚衰老過程中起重要作用〔2〕。因此，在氧化應激和各種抗氧化過程之間的因果關系引起了研究者對抗氧化劑在皮膚上應用的興趣。微小RNA(miRNA)是一種長度為22～24 nt的非編碼RNA，通過誘導mRNA衰減和翻譯抑制，從而調控基因的表達〔3〕。近年來，涉及miRNA的疾病數量急劇增加，其中也包括一些皮膚疾病。例如，miR-203a在黑色素瘤中具有腫瘤抑制作用〔4〕。miR-29與腫瘤抑制蛋白p53一樣可促進皮膚衰老過程〔5〕。miR-29a-3p、miR-30a-5p和miR-34a的下調可導致皮膚成纖維細胞的衰老減少〔6〕。

miR-181家族在細胞功能調節中具有重要作用。Neu等〔7〕在對皮膚鱗狀細胞癌(SCC)進行研究時發現，miR-181a通過靶向鼠類肉瘤病毒癌基因(KRAS)在SCC中起著至關重要的腫瘤抑制作用，并且可能成為基于miRNA療法的候選靶標。

本研究擬在細胞水平探討氧化應激刺激之后的皮膚成纖維細胞中miR-181a-5p具體作用機制，為進一步探索氧化應激導致的皮膚衰老機制，尋找抗衰老的新靶點提供依據。

1 材料與方法

1.1細胞株 大鼠皮膚成纖維樣細胞RS1購自武漢普諾賽生命科學技術有限公司(貨號：CL-0430)。

1.2主要試劑與儀器 試劑：DMEM培養基(Hyclone)，H2O2(sigma)，反轉錄試劑盒(TAKARA)，SYBR Green PCR 試劑盒(KAPA Biosystems)，CCK8試劑盒，過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX) 、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測定試劑盒(南京建成)，Lipofectamine?RNAiMAX轉染試劑(Invitrogen公司)，兔抗細胞外信號調節激酶(ERK)1/2多克隆抗體、兔抗Ⅰ型膠原α1鏈(COL1A1)多克隆抗體、兔抗基質金屬蛋白酶(MMP)2多克隆抗體(bioswamp)等。儀器：CFX-Connect 96熒光定量 PCR 儀(Bio-Rad)，Nano-300 超微量分光光度計(杭州奧盛)，352型酶標儀(芬蘭Labsystems Multiskan MS公司)，DMIL LED倒置熒光顯微鏡(Leica 公司)等。

1.3細胞培養與轉染 將大鼠皮膚成纖維樣細胞RS1(含15%胎牛血清的DMEM培養基)于37℃、5% CO2培養箱中培養，將細胞以2×103個/孔、2×105個/孔接種于96孔板和6孔板，待細胞融合度為70%～80%時進行轉染。按照試劑盒說明書將Opti-MEM無血清培養基分別稀釋miR-181a-5p模擬物(mimic)、抑制物(inhibitor)及其無關序列(negative control)和Lipofectamine?RNAiMAX，室溫靜置5 min后混勻共孵育，之后加入培養板，4 h之后換完全培養基繼續培養。

1.4實驗分組 實驗細胞按照不同處理分為對照組(不經任何處理)，模型組(200 μmol/L的H2O2處理6 h)，模型+miR-181a mimic組(200 μmol/L的H2O2處理6 h后，轉染miR-181a-5p mimic)，模型+mimic-NC組(200 μmol/L的H2O2處理6 h后，轉染miR-181a-5p mimic NC)，模型+miR-181a inhibitor組(200 μmol/L的H2O2處理6 h后，轉染miR-181a-5p inhibitor)，模型+ inhibitor-NC組(200 μmol/L的H2O2處理6 h后，轉染miR-181a-5p inhibitor NC)。

1.5Real-time PCR檢測P53、衰老標記蛋白(SMP)30、COL1A1及miR-181a-5p 轉染24 h后，按照Trizol試劑盒說明書提取細胞總RNA，反轉錄試劑盒說明書進行定量檢測。采用Primer Premier 5.0設計PCR擴增引物，并送至武漢天一輝遠生物技術有限公司合成，引物序列：P53正義鏈：5′-TGCGTGTGGAGTATTTGG-3′,反義鏈：5′-GATTCTCTTCCTCTGTGCG-3′;SMP30正義鏈：5′-TGGTTTGGATTGGTCG-3′,反義鏈：5′-CACTTCTGCGGTTGGA-3′;COL1A1正義鏈：5′-AGGTGTTGTGCGATGACG-3′,反義鏈：5′-AGCTGGGGAGCAAAGTTT-3′;GAPDH正義鏈：5′-CCACTCCTCCACCTTTG-3′,反義鏈：5′-CACCACCCTGTTGCTG-3′;miR-181a-5p正義鏈：5′-GGGAACATTCAACGCTGT-3′,反義鏈：5′-AGAAGCCCGCTACCTG-3′;U6正義鏈：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′,反義鏈：5′-ACGCTTCACG AATTTGCGTGT-3′。

1.6CCK8檢測細胞增殖 收集對數期細胞，以每樣品3復孔接種于96孔板(每孔180 μl，細胞密度5×103個/孔)，按1.4中分組方式培養細胞，轉染24 h后向每孔加入10 μl CCK8溶液，繼續培養4 h，酶標儀450 nm波長處測定OD值。計算細胞增殖率(增殖率=試驗組OD值/對照組OD值×100%)。

1.7生化試劑盒檢測CAT、GSH-PX及T-SOD活性 細胞轉染24 h后，收集各組細胞培養上清液，按照試劑盒使用說明書測定CAT、GSH-PX及T-SOD活性。

1.8免疫熒光檢測COL1A1及MMP2的表達 細胞轉染24 h后，以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入4%多聚甲醛室溫固定30 min，以PBS洗滌2次，0.5%Triton X-100室溫通透20 min，PBS洗2次，5%BSA，37℃封閉1 h，棄封閉液，之后加入相應COL1A1、MMP2抗體4℃，孵育過夜，PBS洗2次后加入熒光標記二抗，37℃，孵育1 h，經PBS洗滌，加入抗熒光淬滅封片液進行封片，置熒光顯微鏡下觀察，使用Image J軟件分析免疫熒光強度。

1.9統計學方法 采用SPSS19.0統計學軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1miR-181a-5p轉染效率檢測 與對照組(1.00±0.03)相比，miR-181a-5p mimics組RS1細胞miR-181a-5p表達量顯著上升(4.37±0.26，P<0.01)，miR-181a-5p inhibitor組細胞miR-181a-5p表達量顯著下降(0.14±0.01，P<0.01)，mimics-NC及inhibitor-NC組，miR-181a-5p表達量無顯著變化(0.85±0.07、0.87±0.03；P>0.05)。

2.2miR-181a對細胞增殖的影響 與對照組〔(100.00±0.14)%〕相比，模型組細胞增殖率顯著降低〔(49.68±1.21)%,P<0.01〕。與模型組相比，miR-181a-5p mimics組細胞增殖率顯著降低〔(39.22±1.16)%,P<0.01〕，miR-181a-5p inhibitor組細胞增殖率顯著升高〔(64.12±1.27)%,P<0.01〕。mimic-NC組及inhibitor-NC組細胞增殖率〔(47.16±1.33)%、(48.95±2.26)%〕均無顯著變化(P>0.05)。

2.3miR-181a對細胞內CAT、GSH-Px及T-SOD活力的影響 與對照組相比，模型組RS1細胞內CAT、GSH-Px及T-SOD活力顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，經H2O2處理的RS1細胞轉染miR-181a mimics后，CAT、GSH-Px及T-SOD活力顯著降低(P<0.01)。轉染miR-181a inhibitor后，細胞內CAT、GSH-Px及T-SOD活力顯著升高(P<0.01)。見表1。

2.4miR-181a對P53、SMP30、COL1A1 mRNA表達水平的影響 與對照組相比，模型組RS1細胞的P53及SMP30表達量顯著升高(P<0.01)，COL1A1表達量顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，經H2O2處理的RS1細胞轉染miR-181a mimics后，P53及表達量SMP30表達量顯著升高(P<0.01)，COL1A1表達量顯著降低(P<0.01)。細胞轉染miR-181a inhibitor后，P53及表達量SMP30表達量顯著降低(P<0.05)，COL1A1表達量顯著升高(P<0.01)。見表1。

2.5miR-181a對細胞內COL1A1與MMP2表達的影響 與對照組相比，模型組RS1細胞COL1A1熒光強度顯著降低(P<0.01)，MMP2熒光強度顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，經H2O2處理的RS1轉染miR-181a-5p mimic后，COL1A1熒光強度顯著降低(P<0.01)，MMP2熒光強度顯著升高(P<0.01)；細胞轉染miR-181a-5p inhibitor后，COL1A1熒光強度顯著升高(P<0.01)，MMP2熒光強度顯著降低(P<0.01)。見圖1、圖2、表2。

表1 各組細胞生化指標活性及細胞內P53、SMP30、COL1A1 mRNA表達水平比較

圖1 各組細胞COL1A1表達情況(免疫熒光染色，×200)

圖2 各組細胞MMP2表達情況(免疫熒光染色，×200)

表2 各組細胞COL1A1和MMP2免疫熒光強度的比較

3 討 論

紫外線輻射是造成皮膚衰老的主要外在因素。紫外線會刺激過多的活性氧(ROS)生成，使細胞的抗氧化劑防御系統不堪重負，并導致皮膚氧化應激〔8，9〕。這些防御系統包括保護酶，例如超氧化物歧化酶(SOD)，CAT和GSH-Px及非酶機制〔10〕。同時，ROS的過度積累會導致細胞大分子的氧化損傷，包括DNA修飾，脂質過氧化和凋亡信號轉導，從而改變細胞功能〔11，12〕。

近年來，已有研究報道miR-181a與細胞內ROS、鈣離子調節相關〔13，14〕。miR-181家族在細胞功能調節中具有重要的作用，例如，miR-181a/b在皮膚衰老及持續衰老之后的細胞中上調，其靶向調節STIR1發揮促衰老的作用，在衰老過程中，可特異性的調控ⅩⅥ型細胞膠原及胞外基質蛋白的表達〔13〕。miR-181a在H2O2處理6 h后的MSCs細胞中呈現上調表達的狀態，并且這種miR-181a上調通過下調己糖激酶(HK)Ⅱ誘導細胞死亡〔15〕。

p53可參與500多個靶基因的調控，從而控制廣泛的細胞過程，其中包括代謝適應，DNA修復，細胞周期停滯，凋亡和衰老，在端粒酶活性缺失的小鼠體內過表達p53可導致衰老過程的激活和腫瘤進程的抑制，而抑制p53的表達可導致衰老的旁路激活和腫瘤的發生發展〔16〕。SMP30是一種新型的衰老標記分子，其表達在衰老過程中會降低〔17〕。近年來，特別是在大鼠和小鼠肝臟中的研究表明，SMP30可參與多種生物調節途徑，其中包括細胞內氧化應激水平的調節〔18〕。

Ⅰ型膠原是皮膚中最豐富的蛋白，Ⅰ型膠原蛋白是在皮膚纖維化，傷口愈合，組織重塑及皮膚衰老中起作用的主要成分〔19〕。組織學和超微結構研究表明，在老化的皮膚中，其主要的改變是真皮層Ⅰ型膠原的大量損失，這也被認為是皺紋形成的主要原因〔19〕。同時，MMP和透明質酸酶在皮膚衰老過程中也發揮著極其重要的作用，可導致彈性蛋白酶，膠原酶和透明質酸酶的產量增加，從而導致膠原蛋白，彈性蛋白和透明質酸的降解，促進皮膚老化〔20〕。

本研究結果顯示，轉染miR-181a mimic后，細胞活力明顯降低，衰老標記基因P53及SMP30表達量明顯升高，同時，細胞內生化指標CAT、GSH-PX、T-SOD活性均顯著升高。另外，免疫熒光結果顯示細胞內COL1A1表達受到抑制，MMP2則表達增強。

綜上所述，miR-181a-5p可促進氧化應激誘導的大鼠皮膚成纖維樣細胞衰老進程，其機制可能與下調COL1A1表達，上調MMP2表達有關。