依達拉奉通過抗炎、抗氧化對大鼠缺氧性肺動脈高壓病理發展的抑制作用

金海峰 王月飛 郭林娜 姜楊 李雪梅 劉吉成 周忠光 洪炳哲

(齊齊哈爾醫學院 1解剖教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161000；2醫藥科學研究院；3 生理教研室；4 臨床教學中心；5 黑龍江中醫藥大學中西醫結合基礎醫學院；6 齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院心內科)

肺動脈高壓是一種進行性閉塞性肺血管病變，其病因多樣，病死率極高〔1〕。根據世界衛生組織(WHO)的分類，肺動脈高壓分為5個亞型，其中缺氧性肺動脈高壓(HPH)屬于第3亞型，主要由支氣管肺發育不良、肺泡低通氣障礙、慢性阻塞性肺疾病、肺間質性疾病或長期處于高海拔地區而導致的肺泡長期處于缺氧狀態而引起的，是一種老年人多發的慢性疾病〔2,3〕。因目前臨床上尚缺乏有效治療藥物，HPH又稱之為心血管系統中的“癌癥”，如何有效防治HPH已成為目前急需解決的一項重大難題。依達拉奉作為一種強效自由基清除劑，可通過抑制脂質過氧化反應，從而抑制腦細胞、神經細胞的氧化損傷，現已成為臨床治療急性腦梗死的常規藥物。本研究通過建立HPH大鼠模型，并給予依達拉奉進行干預，探討其對HPH病理發展的可能作用及其相關機制。

1 材料和方法

1.1藥物與試劑 依達拉奉(批號：BCBR2606V)，購自美國Sigma-Aldrich公司。丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α檢測試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司。IL-1β抗體、TNF-α抗體、α-平滑肌肌動蛋白(SMA)抗體、GAPDH抗體均購自Santa Cruz Biotechnology。

1.2實驗動物與分組 21只雄性SD大鼠(180～200g)購自齊齊哈爾醫學院實驗動物中心〔實驗動物合格證號：SCXK(黑)2016-001-001〕。將大鼠隨機分為對照組、HPH組、依達拉奉組各7只。HPH組和依達拉奉組大鼠置于低氧箱中，低氧時間為18 h/d，持續28 d，低氧箱中O2濃度為10%。依達拉奉以5 mg/(kg·d)的用量，對大鼠進行腹腔注射；HPH組腹腔注射同等體積生理鹽水。實驗動物于低氧處理1 w前開始給藥直至實驗結束。低氧箱中大鼠呼出的CO2及水蒸氣，利用堿石灰及無水氯化鈣進行吸收。

1.3血流動力學及右心室肥厚指標檢測 實驗結束后，大鼠進行腹腔注射麻醉，將充滿肝素的PE導管經大鼠右側頸靜脈插入到右心室，利用BL-420S生物信號采集與分析系統，監測大鼠的右心室收縮壓力(RVSP)，用于判定大鼠肺動脈壓力變化。之后游離出大鼠心臟，去除心房，將心室分成右心室(RV)和左心室+室間隔(LV+S)，分別稱重并計算出比值RV/(LV+S)，用于判定右心室肥厚程度。

1.4肺組織蘇木素-伊紅(HE)染色 將肺組織剪成3 mm3大小的組織塊，利用4%多聚甲醛進行固定、梯度酒精脫水，并進行透明、浸蠟、包埋等操作，再將組織塊切成4 μm厚的切片，進行HE染色。選取直徑在50～200 μm之間的肺動脈，利用Image Pro Plus6.0圖像分析系統進行觀察并測量所選肺動脈的血管總面積、中膜面積、外徑及內徑。利用下列公式判定肺動脈增厚程度：肺動脈厚度百分比(WT%)=(外徑-內徑)/外徑×100%；肺動脈面積百分比(WA%)=中膜面積/血管面積×100%。

1.5肺組織免疫組化染色 將肺組織石蠟切片進行脫蠟、復水、抗原修復、3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶、5%山羊血清封閉后，進行α-SMA的免疫組化染色，并利用Image Pro Plus圖像分析系統對所選肺動脈進行α-SMA光密度值(OD值)測定。

1.6MDA、IL-1β、TNF-α含量檢測 通過大鼠頸外動脈抽取動脈血離心并提取血清，利用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒檢測血清中的MDA、IL-1β、TNF-α含量。將肺組織制作成勻漿、離心并提取上清液，檢測肺組織中的MDA含量。

1.7肺組織IL-1β和TNF-α蛋白檢測 提取肺組織總蛋白，利用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白濃度。等量蛋白經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，經5%牛奶封閉，一抗、二抗孵育后，利用ECL發光試劑盒，檢測大鼠肺組織中IL-1β和TNF-α蛋白表達變化。

1.8統計學分析 采用SPSS22.0軟件行方差分析。

2 結 果

2.1依達拉奉抑制了肺動脈壓力的升高及右心室的肥厚 HPH組RVSP和RV/(LV+S)較對照組顯著升高(P<0.01)；依達拉奉組RVSP、RV/(LV+S)較HPH組顯著降低(P<0.01)，見圖1，表1。

2.2依達拉奉抑制了肺動脈結構重建 肺組織HE染色結果顯示，與對照組相比，HPH組WT%和WA%顯著升高(P<0.01)，肺動脈管壁明顯增厚、管腔明顯狹小，表明肺動脈結構重建明顯，依達拉奉組肺動脈結構重建受到有效抑制(P<0.01)，見表1，圖2。

2.3依達拉奉抑制了肺動脈α-SMA的高表達 對肺組織進行的平滑肌標志性蛋白α-SMA免疫組化染色結果顯示，HPH組肺動脈α-SMA的OD值較對照組顯著升高(P<0.01)，證明由低氧誘導的肺動脈結構重建，主要是因為肺動脈中層平滑肌細胞的過度增生而導致。而依達拉奉組肺動脈α-SMA OD值較HPH組顯著降低(P<0.01)，見表1，圖3。

2.4依達拉奉降低了血清及肺組織中的MDA含量 與對照組相比，HPH組血清及肺組織中MDA含量顯著升高(P<0.01)；達拉奉組血清及肺組織中MDA含量較HPH組顯著降低(P<0.01)，提示依達拉奉顯著降低了低氧誘導的HPH大鼠體內的氧化損傷，見表2。

2.5依達拉奉降低了大鼠體內炎癥因子的高表達 HPH組血清中的炎癥因子IL-1β和TNF-α含量及肺組織中的IL-1β和TNF-α蛋白表達量較對照組顯著升高(P<0.01)；而依達拉奉組血清中IL-1β、TNF-α含量及肺組織中IL-1β、TNF-α蛋白表達量較HPH組顯著降低(P<0.01)，見表2，圖4。

圖1 各組大鼠RVSP

表1 各組RVSP、RV/(LV+S)、肺動脈WT%值、WA%值、α-SMA的OD值

圖2 各組肺組織HE染色(×400)

圖3 各組肺組織α-SMA免疫組化染色(×400)

表2 各組血清及肺組織中的MDA含量及血清中IL-1β、TNF-α含量比較

圖4 Western印跡檢測各組IL-1β和TNF-α蛋白表達

3 討 論

HPH病理發展特點為長期低氧導致的肺動脈內皮細胞功能失調及肺動脈中層平滑肌細胞的過度增生性改變，從而引起肺動脈結構重建、管腔逐漸閉塞、動脈阻力增加、順應性降低，隨著病情進一步發展及肺動脈壓力的持續性升高，最終將導致右心室衰竭〔1,4〕。目前的藥理學治療側重于利用血管舒張藥物以緩解癥狀，但對血管重建的影響有限，并且長期應用甚至會加重HPH患者的缺氧狀態〔5〕。作為一種強效抗氧化劑，依達拉奉最早于2001年在日本被批準用于急性腦梗死患者的常規治療藥物，并于2015年進一步被用于肌萎縮側索硬化的治療〔6,7〕。近年，除神經系統外，依達拉奉在心血管系統相關疾病中的治療作用已得到廣泛研究。諸多實驗研究已證明，依達拉奉可通過抗氧化、抗感染、抗凋亡等機制，對動脈粥樣硬化、高血壓、心肌缺血再灌注損傷、心肌梗死及擴張性心肌病等具有良好的保護及治療作用〔8,9〕。雖然，依達拉奉目前已被證明具有抗氧化、抗感染及治療心血管諸多疾病的作用，但是在HPH病理發展中的可能作用目前還沒有相關的文獻報道。本研究結果提示，依達拉奉能夠明顯抑制低氧誘導的大鼠肺動脈壓力的升高及右心室的肥厚，并通過抑制肺動脈中層平滑肌細胞的過度增生，從而有效緩解肺動脈的結構重建。

在HPH的病理發展過程中，由低氧誘導的活性氧的過量產生起著至關重要的作用。在低氧條件下，肺組織細胞中的NADPH氧化酶系統及線粒體等會產生大量過氧化氫、超氧化物陰離子等活性氧物質，從而導致肺組織的氧化應激損傷〔10〕。活性氧不僅損傷肺動脈內皮細胞使其喪失肺動脈與血液之間的屏障功能，還可作為信號傳遞中的第二信使激活其下游一系列與細胞增殖相關的信號通路，從而促進肺動脈平滑肌細胞的過度增生〔11〕。大量研究表明，敲除小鼠體內的NADPH氧化酶亞型Nox4或Nox2或給予大鼠抗氧化酶藥物，均能夠有效抑制小鼠和大鼠HPH的發生與發展〔11～13〕。因此，抑制低氧誘導的氧化應激損傷，是防治HPH病理發展的有效方法之一。MDA是脂質過氧化的標志性產物，其含量的變化代表著生物體內氧化應激損傷的程度。本研究發現，依達拉奉能夠明顯降低HPH模型大鼠肺組織及血清中的MDA高表達，提示依達拉奉在HPH病理發展過程中對低氧誘導的氧化應激損傷具有良好的抑制作用。

另外，由低氧誘導的炎癥反應是促進HPH的病理發展的另一重要因素。將實驗動物暴露于慢性低氧環境下，會引起大量炎癥細胞及炎癥因子在肺部聚集，并進一步破壞肺動脈內皮細胞的完整性及促進肺動脈壁中層平滑肌細胞的過度增生，從而導致肺動脈的結構重建〔14〕。炎癥因子中IL-1β和TNF-α在幾乎全部肺動脈高壓患者的血清中均增高，并且臨床上將IL-1β和TNF-α的表達變化作為患者疾病發展的嚴重程度及預后的重要指標〔15〕。抑制動物體內的IL-1β和TNF-α高表達，能夠有效改善低氧誘導的肺動脈平滑肌細胞的過度增生及肺動脈結構重建，從而抑制HPH的病理發展〔16〕。本研究結果提示，在大鼠HPH病理發展過程中，依達拉奉能夠有效抑制炎癥因子IL-1β和TNF-α的高表達。

綜上，依達拉奉作為一種強效抗氧化劑，不僅通過抑制大鼠體內低氧誘導的氧化應激損傷，并通過抑制炎癥反應，改善HPH大鼠肺動脈平滑肌細胞的過度增生、肺動脈結構重建、肺動脈壓力的升高及右心室的肥厚，從而抑制HPH的病理發展。