缺氧誘導因子誘導轉錄因子COUP-TFⅡ轉錄激活

許曉亮 劉輝 武燃 王蕾 左偉文 王天濤

(1唐山市第二醫院口腔科,河北 唐山 063000;2華北理工大學附屬醫院口腔科；3唐山職業技術學院口腔系;4華北理工大學基礎醫學院)

雞卵清蛋白上游啟動子轉錄因子(COUP-TF)Ⅱ是核受體超家族成員之一〔1～3〕，COUP-TFⅡ存在于靜脈內皮細胞(ECs)中，研究證實COUP-TFⅡ參與并調節著血管生成、器官形成及神經發育等諸多生物學過程〔4〕。作為一種調節蛋白，COUP-TFⅡ 能促進新生血管分化為具有不同結構和功能的靜脈和動脈，但其調節功能的機制尚不清楚。缺氧是一種生理刺激，許多病理狀態都受到缺氧的影響，缺氧誘導因子(HIFs)是最主要的參與缺氧應答的轉錄因子，調控多種基因表達〔5,6〕。在哺乳動物中HIF-1α 和HIF-2α 是研究較多的HIF 亞基，HIF-1α 和HIF-2α 可激活涉及血管生成、代謝、細胞存活和炎癥調節的多種基因〔7〕，在細胞缺氧反應中起著關鍵作用，參與了缺氧條件下腫瘤細胞的多種信號傳導途徑〔8,9〕。本研究從轉錄水平確定缺氧是否能誘導COUP-TFⅡ表達，并闡明其機制。

1 材料和方法

1.1質粒構建 利用人類基因組DNA(69237；Merck&CoInc.)，通過聚合酶鏈反應(PCR)分析擴增了 COUP-TFⅡ近端啟動子區，該啟動子區包含HIF-1α/HIF-2α缺氧反應元件(HRE)的一致DNA結合位點。在COUP-TFⅡ片段插入螢火蟲熒光素酶編碼區上游后，使用基于PCR的定點突變將HRE序列從ACGTG突變為ACATA。所得的2個質粒稱為野生型(WT)-COUP-TFⅡ-Luc和突變型(MUT)-COUP-TFⅡ-Luc。

1.2熒光素酶活性檢測 構建COUP-TFⅡ3′UTR-熒光素酶報告基因質粒 pMIR-COUP-TFⅡ-WT及pMIR-COUP-TFⅡ-WUT。將HIF-1α mimics、HIF-2α mimics、陰性對照、缺氧模擬劑CoCl2、磷酸鹽緩沖液(PBS)、熒光素酶、pMIR-COUP-TFⅡ-WT、pMIR-COUP-TFⅡ-WUT及陰性對照共轉染EA.hy926細胞。細胞培養物孵育36 h，收集細胞培養物。使用雙熒光素酶報告試劑盒(Amboin)測定熒光素酶活性。

1.3細胞培養和轉染 人臍靜脈細胞融合細胞EA.hy926細胞(ATCC，美國)用低糖杜爾伯科改良伊格爾培養基(DMEM)在37℃、3%O2、5%CO2和92%N2的缺氧培養箱中培養。然后細胞用DMEM在正常氧氣條件下(37℃、5%CO2、21%O2和74% N2)的加濕培養箱中培養細胞48 h。收集細胞進一步分析。用0.25%胰蛋白酶消化生長良好的EA.hy926細胞。每孔加入2 ml DMEM，放入37℃ 5%CO2孵化器。細胞按70%細胞密度分組。將EAhy926細胞分為空載體組、血管內皮生長因子(VEGF)組、COUP-TFⅡ組、HIF-1α組、HIF-2α組、siHIF-1α組、siHIF-2α組、NC對照組。每組按順序分別滴入空質粒、VEGF、COUP-TFⅡ、HIF-1α、HIF-2α表達質粒(均為10 μg)、HIF-1α siRNA(siHIF-1α，50 nmol/L)、HIF-2α siRNA(siHIF2α，50 nmol/L)及對應的陽性對照質粒在37℃和5%CO2的條件下共混孵化器繼續發展，8 h后更換新鮮培養基。轉染序列：HIF-1α siRNA正義鏈:5′-GTCTGCAACATGGAAGGTA-3′，HIF-1α siRNA 反義鏈:5′-GTC-GACAGCCTCACAA-3′；NC siRNA-1正義鏈:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，NC siRNA-1反義鏈:5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′；HIF-2α siRNA 正義鏈:5′-GCCGTACTGTCAACCTCAAGT-3′，HIF-2α siRNA 反義鏈:5′-GCCATCATCTCTCTGG-AT TTC-3′；NC siRNA-2正義鏈:5′-UAA AUCUGCA-AACCACUGGTT-3′，NC siRNA-2反義鏈:5′-ACGUG-ACACGUUCGGAGAATT-3′。

1.4實時熒光定量反轉錄(RT)-PCR 依照Trizol實驗方法從細胞中提取總RNA，按RT-PCR檢測試劑盒說明行PCR，應用β-actin 作為內參基因，反應體系為20 μl，重復反應3次，檢測結果采用2-△△Ct值計算。引物序列：HIF-1α正義鏈：5′-GTTGCCTGGAGCCCAGAGTG-3′，反義鏈：5′-CTGCCTTCAGCTGCCCTTGT-3′;HIF-2α正義鏈：5′-ACAGCTGACA AGAAAAAAAAGAG-3′，反義鏈： 5′-GGTGGCCTGGT CCAGAGC-3′;GAPDH 正義鏈：5′-AATGGACAACTGGTCGTGGAC-3′，反義鏈：5′-CCCTCCAGGG GATC TGTTTG-3′。

1.5Western印跡 從細胞中提取總蛋白，檢測濃度后，在12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用COUP-TFⅡ抗體進行Western印跡分析。

1.6染色質免疫沉淀分析 (ChIP) 按照ChIP試劑盒說明進行ChIP，試驗重復3次。

1.7小鼠后肢缺血模型 C57BL/6小鼠(n=12，雄性，約25 g，12 w)從北京協和醫科大學實驗動物科學研究所購買，飼養條件：溫度24℃，室內控制，晝夜循環照明，供水充足，飼料正常。隨機分成Sham組和后肢缺少小鼠模型(PAD)組腹腔注射水合氯醛(3.33%)、400 mg/kg麻醉。腹腔注射0.5 ml抗生素，置37℃孵育箱中孵育。應用彩色多普勒超聲檢測結扎部位下游血流速度，判斷缺血后肢模型是否成功。判定標準：術后血流速度降至術前值的10%以下，血流頻譜變化明顯，為造模成功。

1.8免疫組化分析 4%多聚甲醛灌注處死缺血后肢小鼠。灌注后，將小鼠后肢浸入4%多聚甲醛4 h，轉移至70%乙醇中。將組織標本石蠟包埋，石蠟切片，厚度5 μm。免疫染色前，5 μm組織切片梯度脫蠟、水化。水化后的組織切片上滴加3% H2O2溶液室溫孵育15 min以阻斷內源性過氧化物酶活性。用10 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中的切片微波15 min，加入一抗4℃過夜。隨后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，37℃孵育30 min。而后進行染色，而后進行脫水和中性樹脂封片。采用正置顯微鏡觀察切片陽性信號。

1.9統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1EA.hy926細胞轉染成功 各組HIF-1α、HIF-2α mRNA表達差異有統計學意義(P<0.001)。HIF-1α組HIF-1α mRNA相對表達水平(36.77±9.06)、HIF-2α組HIF-2α mRNA相對表達水平(34.06±7.89)高于空載體組HIF-1α mRNA(12.35±2.64)、HIF-2α mRNA相對表達水平(13.31±2.52)，差異有統計學意義(P<0.001)。siHIF-1α組HIF-1α mRNA相對表達水平(6.07±1.84)、siHIF-2α組HIF-2α mRNA相對表達水平(8.96±1.06)低于NC對照組(10.65±2.36、10.23±1.60)，差異有統計學意義(P<0.001)。表明HIF-1α、HIF-2α、HIF-1α siRNA、HIF-2α siRNA均成功轉染進EA.hy926細胞。

2.2COUP-TFⅡ啟動子調節區與HIF-1α、HIF-2α存在一致的HRE COUP-TFⅡ啟動子和調控區HRE位置權重矩陣(PWM)見圖1A。從Ensembl基因組瀏覽器獲得的COUP-TFⅡ啟動子和調控區的序列，利用ConTra v2(http://bioit2.irc.ugent.be/contra/v3/)服務器識別結合轉錄因子的DNA序列基序。結果發現對于COUP-TFⅡ 轉錄起始位點與HIF-1α/HIF-2α存在一致的HRE ，見圖1B。

圖1 用生物信息學方法分析COUP-TFⅡ啟動子區HIF-1α/HIF-2α結合位點(HRE)

2.3缺氧條件下COUP-TFⅡ啟動子激活 創建了1個WT COUP-TFⅡ-Luc報告載體，其中包含COUP-TFⅡ-TSS的-400至-100 bp的DNA片段，見圖2。在常氧或低氧條件下培養EA.hy926細胞，并測定熒光素酶活性以確定COUP-TFⅡ啟動子的轉錄激活。與PBS組(33.77±2.87)相比，CoCl2組COUP TFⅡ啟動子活性(68.35±6.34)增加約2倍。在缺氧條件下，COUP-TFⅡ啟動子活性(82.47±7.29)比在正常氧氣條件下(29.87±2.31)提高約2.5倍。用突變的HRE(ACGTG>ACATA)構建MUT-COUP TFⅡ-Luc報告載體進行以上實驗。這種突變消除了缺氧對COUP-TFⅡ啟動子的作用。

圖2 COUP-TFⅡ啟動子熒光素酶報告基因(COUP-TFⅡ-Luc)示意圖

2.4缺氧誘導COUP-TFⅡ在細胞內的表達 與常氧條件相比，EA.hy926細胞在缺氧條件下，6 h COUP-TFⅡ 水平無明顯差異(t=0.731；P>0.05)。持續缺氧72 h后，在顯微鏡下觀察到大量細胞凋亡(>50%)，將干擾實驗結果。選取3個時間點(12、24、48 h)檢測COUP-TFⅡ 的mRNA和蛋白表達變化。見圖3。EA.hy926細胞在缺氧條件下48 h后COUP-TFⅡ mRNA表達(4.25±0.37)較VEGF mRNA表達(3.43±0.28)明顯增加(P<0.001)；與常氧條件下COUP-TFⅡ蛋白表達(1.00±0.09)相比，缺氧12、24、48 h后COUP-TFⅡ蛋白表達(3.35±0.27、3.79±0.38、4.41±0.45)明顯增加(P<0.001)。

2.5HIF-1α和HIF-2α誘導COUP-TFⅡ啟動子激活 將WT-COUP-TFⅡ-Luc質粒和HIF-1α或HIF-2α共轉染到EA.hy926細胞中。qRT-PCR結果顯示，與對照組〔(33.21±3.52)%、(33.21±3.52)%〕相比，HIF-1α或HIF-2α過表達可顯著增加WT-COUP-TFⅡ-Luc的熒光素酶活性〔(91.64±8.76)%、(99.23±9.41)%；均P<0.001〕。隨后EA.hy926細胞中使用RT-PCR結果顯示，與空載體組相比(1.00±0.09、1.00±0.09)，過表達HIF-1α或HIF-2α顯著增加COUP-TFⅡ表達(3.11±0.29、5.21±0.48；均P<0.001)。 Western印跡結果顯示，與空載體組比較(1.00±0.10)，過表達HIF-1α或HIF-2α明顯增加COUP-TFⅡ蛋白表達(2.78±0.21、3.89±0.39；均P<0.001)。在EA.hy926細胞中用siRNA降低HIF-1α和HIF-2α表達，在缺氧條件下培養細胞48 h后Western印跡檢測COUP-TFⅡ的表達水平，結果顯示，HIF-1α或HIF-2α降低后COUP-TFⅡ蛋白表達(0.67±0.05、0.54±0.04)明顯降低(P<0.001)，見圖4。

圖3 EA.hy926細胞在缺氧條件下不同時間點COUP-TFⅡ蛋白表達

2.6HIF-1α、HIF-2α與COUP-TFⅡHRE的相互作用 EA.hy926細胞缺氧時，HIF-1α或HIF-2α能與COUP-TFⅡ啟動子結合，見圖5。用HIF-1α 或HIF-2α特異性抗體免疫沉淀EA.hy926細胞COUP-TFⅡ、HRE與HIF-1α或HIF-2α之間的蛋白DNA復合物，同時使用羊抗兔IgG作為對照組，采用RT-PCR對COUP-TFⅡ-HRE位點進行免疫沉淀物中的DNA分析。COUP-TFⅡ-HRE含有抗HIF-1α或抗HIF-2α的抗體(1.00±0.95 vs 18.53±1.67；1.00±0.95 vs 23.12±1.98，P<0.01)，但不含有羊抗兔IgG，相比之下，COUP-TFⅡ無HRE遠端區的無法檢測到PCR信號(P>0.05)，即HIF-1α和HIF-2α均能與COUP-TFⅡ-HRE特異性結合，但不能與無HRE的遠端結合。以上結果顯示HIF-1α或HIF-2α與COUP-TFⅡHRE之間存在相互作用。

圖5 ChIP分析HIF-1α和HIF-2α與COUP-TFⅡ相互作用

2.7COUP-TFⅡ在小鼠缺血后肢的表達增加 相比Sham組，PAD組COUP-TFⅡ的蛋白水平明顯升高，見圖6。與Sham組(17.56±1.56)相比，PAD組每個細胞的IOD值(24.13±2.27)明顯升高(P<0.01)。

圖6 COUP-TFⅡ在小鼠缺血后肢表達(IHC染色，×500)

3 討 論

本研究結果表明，缺氧誘導因子HIF-1α和HIF-2α參與調控COUP-TFⅡ表達。COUP-TFⅡ又被稱為NR2F2，已經證實在神經發生中起著關鍵作用，是腫瘤微環境中一種重要的調節血管生成生長因子〔10,11〕。在小鼠模型中，破壞COUP-TFⅡ可導致血管生成和心血管疾病的生成〔12,13〕。HIF參與調控多種基因的表達，如血管生成、離子轉運、細胞外基質合成、細胞增殖、凋亡及腫瘤侵襲性等〔14〕。HIF由不穩定的α亞基和穩定的β亞基組成，可與HRE結合。已有研究表明，HIF-1α和HIF-2α對靶基因的特異性起重要作用，而C端激活區則激活了共同的靶基因〔15〕。研究表明HIF通常可由缺氧條件誘導〔16〕。在本研究中，建立了一個EA.hy926細胞系模型，并觀察到HIF-1α和HIF-2α均可單獨激活COUP-TFⅡ表達。當HIF-1α或HIF-2α被敲除時，COUP-TFⅡ蛋白在缺氧條件下的表達水平被顯著抑制，表明HIF-1α和(或)HIF-2α參與COUP-TFⅡ轉錄反應。

綜上所述，本研究結果提示缺氧誘導因子 HIF-1α，HIF-2α可誘導COUP-TFⅡ mRNA和蛋白表達，同時缺氧誘導COUP-TFⅡ表達在生理和病理過程中的潛在作用可能作為未來的一個前瞻性研究重點。