植物源農(nóng)藥銀杏酚酸提取工藝研究

張翠翠，于蓓蓓，閆雪生，王 芳，林慧彬*

(1.山東省中醫(yī)藥研究院，山東濟(jì)南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東濟(jì)南 250013)

銀杏(GinkgobilobaL.)俗稱白果，為銀杏科銀杏屬落葉喬木，是裸子植物中最古老的孑遺植物，被譽(yù)為“活化石”，是我國特有的藥用植物，其藥用成分主要包括黃酮類、內(nèi)酯類、有機(jī)酚酸類等，目前銀杏黃酮和內(nèi)酯在臨床上主要用于延緩衰老、改善血液循環(huán)、治療心腦血管疾病、提高機(jī)體免疫力等方面[1-2]。長期以來，人們只重視銀杏的醫(yī)療價(jià)值，含有對人體有強(qiáng)致敏和致突變作用[3-4]銀杏酚酸的外種皮經(jīng)常被作為有毒有害物質(zhì)而脫除。隨著研究的不斷深入，研究人員發(fā)現(xiàn)銀杏酚酸性化合物具有殺菌抑菌[5]、抗炎抗氧化[6]、抗腫瘤[7]、防治病蟲害[8]的藥理作用，尤其是在農(nóng)業(yè)害蟲防治方面具有廣闊應(yīng)用前景[9]。鄭許松等[10]研究了銀杏葉粗提物對桃蚜種群的影響，結(jié)果表明，銀杏葉提取物對桃蚜有較強(qiáng)的拒食作用、胃毒毒殺作用和生長發(fā)育抑制作用。Jacboson[11]研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉和根的提取物對亞洲玉米螟有致死和拒食活性。鄧業(yè)成等[12]測定了銀杏葉及外種皮提取物對褐飛虱、桃蚜和菜粉蝶幼蟲的觸殺毒力，結(jié)果表明，它們對褐飛虱和桃蚜有很高的觸殺活性，對菜粉蝶有一定的觸殺活性。張素軍等[13]研究銀杏酚酸對甜瓜白粉病的防治作用，結(jié)果表明，10%銀杏酚酸懸浮劑對甜瓜白粉病具有良好防效，防效優(yōu)于80%多菌靈可濕性粉劑，且對甜瓜生長安全，是防治甜瓜白粉病較理想的生物藥劑之一。因此，將其提取出來作為一種具有藥效作用的物質(zhì)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)害蟲防治是十分必要的。目前，銀杏酚酸提取工藝有浸提法、超臨界CO2萃取法、回流提取法和超聲萃取法等方法[14-16]，該研究將對銀杏外種皮中銀杏酚酸的提取方法進(jìn)行優(yōu)化，最終以二氯甲烷作為提取溶劑進(jìn)行加熱回流提取，提取效率較高，可行性較好，以期為銀杏外種皮中銀杏酚酸的提取提供一個較好的方法，更好地開發(fā)銀杏的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1儀器。LC-350A超聲波中藥處理機(jī)(濟(jì)寧市中區(qū)魯超儀器廠)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；HH-S4數(shù)顯電子恒溫水浴鍋(江蘇金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠)；DZF-6050型真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；Sartorius BP211D電子天平(上海卓精電子科技有限公司)；Waters 600高效液相色譜儀(沃特世科技有限公司)。

1.1.2試劑。白果新酸(純度≥98%，成都普思生物科技股份有限公司，批號PS000113)；總銀杏酸A(純度≥ 98%，成都普思生物科技股份有限公司，批號11594-201605)；總銀杏酸 B(純度≥ 98%，成都普思生物科技股份有限公司，批號111594-201605)；95%乙醇、石油醚和二氯甲烷為分析純，水為屈臣氏飲用水，甲醇、冰乙酸為色譜純。

1.1.3試材。銀杏外種皮購于山東濟(jì)南，經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院中藥資源室林慧彬研究員鑒定為銀杏科植物銀杏的外種皮。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1樣品的制備。將購買來且經(jīng)過專家鑒定合格的銀杏外種皮放在烘箱中，將烘箱溫度調(diào)至70 ℃烘干，粉碎過60目篩，作為后續(xù)取樣的樣品。

1.2.2銀杏外種皮中銀杏酚酸的含量方法的建立。

1.2.2.1對照品溶液的配制。精密稱取對照品2 mg置10 mL容量瓶中，用甲醇定容，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾即得銀杏酚酸對照品溶液。

1.2.2.2供試品溶液的配制。精密稱取銀杏粉0.2 g置100 mL 圓底燒瓶，加二氯甲烷50 mL，稱定加入銀杏粉和二氯甲烷的圓底燒瓶重量，70 ℃加熱回流提取3 h，稱重并補(bǔ)足失重，過濾取續(xù)濾液3 mL，用甲醇定容至10 mL容量瓶中，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾即得銀杏酚酸供試品溶液。

1.2.2.3色譜條件。 lichrospher C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)高效液相色譜柱；流動相為甲醇-3%乙酸水(92∶8)，流動相流速為1 mL/min，檢測波長為310 nm，柱溫為30 ℃。銀杏酚酸混合物、白果新酸對照品及樣品色譜圖見圖1。

圖 1 對照品及樣品色譜圖

1.2.2.4線性關(guān)系考察。精密稱取2 mg白果新酸置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，精密吸取0.1、0.3、0.5、1.0、1.5 mL分別置于2 mL容量瓶中，用甲醇定容，分別用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得不同濃度的對照品溶液，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)、白果新酸對照品濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=86.828X-0.053 8(r=0.999 6)，結(jié)果表明白果新酸在0.010 35～0.207 00 mg/mL具有良好的線性關(guān)系。

1.2.2.5精密度試驗(yàn)。精密吸取對照品溶液，在310 nm連續(xù)測定峰面積6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示峰面積的RSD為0.6%，表明儀器精密度良好。

1.2.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄HPLC色譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)銀杏酚酸含量的RSD為1.22%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.2.2.7重復(fù)性試驗(yàn)。取銀杏粉末6份，每份約0.2 g，精密稱定重量，按照“1.2.2.2”方法制備供試品溶液，并按“1.2.2.3”色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果發(fā)現(xiàn)銀杏酚酸含量的RSD為1.94%，表明試驗(yàn)重復(fù)性良好。

1.2.2.8加樣回收率試驗(yàn)。精密稱取已知含量的銀杏粉末6份，每份約0.1 g，加入白果新酸對照品，按照“1.2.2.2”方法制備供試品溶液，并按“1.2.2.3”色譜條件進(jìn)樣，使用高效液相色譜法進(jìn)行含量測定[17]，并計(jì)算回收率。從表1可以看出，平均回收率為97.83%，RSD為1.96%，表明該測定方法回收率良好。

表 1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

1.2.3單因素試驗(yàn)。按“1.2.2.2”方法對提取工藝中各因素進(jìn)行考察：①以提取時間1、2、3、4、5 h分別提取；②以提取溫度40、50、60、70、80 ℃分別提取；③以料液比1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12(g∶mL)分別提取；④以提取次數(shù)1、2、3、4、5次分別提取。

1.2.4正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。由文獻(xiàn)研究[18-21]和單因素試驗(yàn)結(jié)果可知各因素對銀杏外種皮銀杏酚酸提取的影響，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)表，以銀杏酚酸提取量為評價(jià)指標(biāo)，對提取溫度、提取時間、料液比、提取次數(shù)進(jìn)行考察。

1.3 數(shù)據(jù)處理利用正交試驗(yàn)助手及Excel等數(shù)據(jù)處理軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)從圖2可以看出，隨著提取時間的延長，提取效率有降低趨勢，所以結(jié)合實(shí)際情況，選擇提取時間1～3 h作為后續(xù)正交試驗(yàn)的因素水平。提取溫度為60 ℃時提取效率最高，選擇提取溫度40～80 ℃作為后續(xù)正交試驗(yàn)的因素水平。料液比在1∶8之前提取效率略有降低趨勢，1∶8之后提取效率大幅提升，所以結(jié)合實(shí)際情況，選擇料液比1∶6～1∶10作為后續(xù)正交試驗(yàn)的因素水平。提取次數(shù)3次時提取效率最高，所以結(jié)合實(shí)際情況，選擇提取次數(shù)1～3次作為后續(xù)正交試驗(yàn)的因素水平。

圖2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2 正交試驗(yàn)從正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析(表2)可知，二氯甲烷提取銀杏外種皮中銀杏酚酸的主次影響因素為B>D>C>A,即提取溫度>提取次數(shù)>料液比>提取時間。方差分析表明，提取溫度對銀杏酚酸提取量有顯著影響，而提取時間對提取量幾乎沒影響，提取次數(shù)和料液比有影響。結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果和生產(chǎn)成本，該試驗(yàn)可以得出最佳的提取工藝條件為A1B2C3D2，即提取時間為1 h，提取溫度為60 ℃，料液比為1∶10，提取次數(shù)為2次。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)經(jīng)過3次工藝驗(yàn)證，銀杏酚酸含量的RSD為0.8%，表明在試驗(yàn)范圍內(nèi)正交試驗(yàn)優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行、重現(xiàn)性好。

3 結(jié)論與討論

該試驗(yàn)選用加熱回流法提取銀杏外種皮中銀杏酚酸，利用HPLC測定其含量。通過單因素篩選主要影響因素，正交試驗(yàn)對提取的最佳工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。確定銀杏酚酸最佳提取工藝：提取溶劑為二氯甲烷，提取溫度為60 ℃，料液比為1∶10，提取時間為1 h，提取次數(shù)為2次。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，該工藝穩(wěn)定可行、重現(xiàn)性好、成本低，銀杏酚酸提取量較高，為銀杏外種皮中銀杏酚酸的提取提供方法學(xué)依據(jù)。

銀杏因其自身經(jīng)過自然選擇進(jìn)化而來的高效防衛(wèi)系統(tǒng),很少受到昆蟲和其他有害生物的侵害,而這種防衛(wèi)作用與植物各器官或部位所具有的次生化學(xué)物質(zhì)有著密切關(guān)系，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)這一切均源于銀杏的酚酸類成分。長期以來人們只重視銀杏的醫(yī)療價(jià)值，含有大量有毒酚酸類成分的銀杏外種皮在加工過程中經(jīng)常被當(dāng)作廢物遺棄，既污染環(huán)境又浪費(fèi)資源。將銀杏外種皮中酚酸類成分提取出來，使其變廢為寶，為植物源農(nóng)藥的開發(fā)奠定了良好基礎(chǔ)，為銀杏的綜合開發(fā)利用提供參考。