昆明西山風(fēng)景區(qū)土壤淡色絲孢菌多樣性分析

許俊杰，董 悅

(臨沂大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東臨沂 276000)

淡色絲孢菌隸屬于真菌界淡色絲孢菌科，是世界性廣泛分布種。在已知的全部絲孢真菌屬種中，淡色絲孢菌占40%～45%[1]，其中很多屬種都是重要的植物病原菌，可以危害多種經(jīng)濟(jì)作物；除危害植物外還可以用于生物防治，也可以產(chǎn)生抗菌、抗腫瘤等次生代謝物。昆明西山風(fēng)景區(qū)位于有“高原明珠”之稱的滇池湖畔，地勢北低南高，最高峰海拔2 507.5 m。西山森林公園具有豐富的植物多樣性，是滇中地區(qū)頗具典型性的山地環(huán)境，植物多且集中，分布有167科、59屬、1 086種灌喬木和其他植物。此外，此地還生長了一些珍稀樹種，如臺檜、鵝耳櫪、化香樹、八角楓、滇紫荊等四季常青的樹木。四季如春的氣候、豐富的植物資源、典型的地理環(huán)境決定了昆明西山風(fēng)景區(qū)土壤中具有豐富的真菌資源，因此，開展土壤淡色絲孢菌的研究具有重要的意義。通過昆明市西山風(fēng)景區(qū)土壤淡色絲孢菌多樣性的研究，旨在為挖掘淡色絲孢菌資源提供理論指導(dǎo)和資源支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集土壤、植物殘體樣品采集自云南昆明西山風(fēng)景區(qū)竹林、防護(hù)林、草坪、山坡林、菜田、農(nóng)田。按蛇形采樣法，每個樣地于0～30 cm處進(jìn)行土壤采集，各采樣點鏟取土樣15份，裝于密封袋中，編號，同時記錄采樣時間、地點、生境及經(jīng)緯度。土樣帶回后置于陰涼處風(fēng)干，將編號相同的土樣混合為1份，每個采樣點混合好取3份土樣作為平行試驗組，共18份土壤樣品。置于冰盒中保存24 h內(nèi)送往實驗室，于4 ℃保存。

1.2 培養(yǎng)基分離培養(yǎng)基為水瓊脂+秸稈培養(yǎng)基；純化培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基為PDB液體培養(yǎng)基(葡萄糖20 g、馬鈴薯200 g、瓊脂15 g、水1 000 mL)[2]。

1.3 土壤真菌的分離、純化利用稀釋涂布平板法[3]進(jìn)行土壤真菌的分離，每個處理設(shè)3個重復(fù)，涂布后置于25 ℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)4～7 d后，對長出的菌落進(jìn)行統(tǒng)計、編號、分離、純化、保存。將純化菌株接種PDA培養(yǎng)基平板上，每隔24 h觀察菌落形態(tài)、顏色、培養(yǎng)基顏色，用載玻片培養(yǎng)法[4]觀察其形態(tài)學(xué)特征。

1.4 土壤真菌群落數(shù)據(jù)分析方法

1.4.1物種豐富度。即群落中的物種數(shù)，在此指各生境采集的土壤樣品中分離得到的淡色絲孢菌的屬級物種數(shù)，以S表示。

1.4.2種群優(yōu)勢度。以Berger-Parker優(yōu)勢度指數(shù)(di)進(jìn)行計算，其公式如下：

di=Ni/N

(1)

式中，N為物種總數(shù)，Ni為第i物種個體總數(shù)(該研究中以屬為單位統(tǒng)計菌落數(shù))。

1.4.3物種多樣性。以Shannon-Wiener多樣性指數(shù)公式進(jìn)行計算，其公式如下：

(2)

式中，H′為物種的多樣指數(shù)，n為物種(該研究中為屬級分類單位)總數(shù)，pi為第i種物種個體數(shù)占群落總個體數(shù)的比例[5]。

1.4.4物種均勻度。采用 Pielou 指數(shù)測定公式[5]計算物種均勻度，其公式如下：

J=H′/lnS

(3)

式中，J為均勻度，H′為Shannon-Wiener多樣性指數(shù)，S為物種總數(shù)。

1.4.5相似性分析。采用 Jaccard系數(shù)公式[5]進(jìn)行相似性分析，其公式如下：

Cj=J/(a+b-J)

(4)

式中，J為群落A與群落B共有的物種數(shù)，a為群落A含有的全部物種數(shù)，b為群落B含有的全部物種數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計用Excel 2003和DPS 7.5統(tǒng)計分析軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤真菌在不同生態(tài)環(huán)境中的分布情況從表1可以看出，6種不同類型的生態(tài)環(huán)境土壤中，真菌的物種組成與分布存在明顯差異。防護(hù)林土壤中真菌屬種總數(shù)最大，為300株，淡色絲孢菌173株。其中，木霉屬真菌67株，鐮刀菌屬46株，青霉屬28株，支頂孢屬32株；草坪中真菌共有194株，淡色絲孢菌149株，其中木霉屬78株，鐮刀菌屬32株，青霉屬26株，支頂孢屬13株。山坡林土壤中真菌共有176株，淡色絲孢菌115株，其中木霉屬42株，鐮刀菌屬41株，青霉屬24株，支頂孢屬8株。竹林土壤中真菌共有170株，淡色絲孢菌85株，其中木霉屬30株，鐮刀菌屬30株，青霉屬16株，支頂孢屬9株；菜田土壤中真菌共有103株，淡色絲孢菌73株，其中木霉屬17株，鐮刀菌屬29株，青霉屬19株，支頂孢屬8株；農(nóng)田土壤中真菌共有179株，淡色絲孢菌131株，其中木霉屬79株，鐮刀菌屬23株，青霉屬27株，支頂孢屬2株。其他種類的真菌在6種生境中分布各有不同，除節(jié)菱孢屬和鏈格孢屬數(shù)量較多外，其他分布較少。淡色絲孢菌共726株，為土壤真菌菌落中的優(yōu)勢種群。

表1 不同生態(tài)環(huán)境中土壤的淡色絲孢真菌及其他物種組成和分布

2.2 昆明西山風(fēng)景區(qū)土壤淡色絲孢菌屬的組成及優(yōu)勢度從采集的18份土壤樣品中分離獲得土壤真菌18屬1 122株，其中淡色絲孢菌726株(表1)。18個屬分別為青霉屬Penicillium、鐮刀菌屬Fusarium、盾殼霉屬Trichothecium、木霉屬Trichoderma、脈孢菌屬Neurospora、節(jié)菱孢屬Arthrinium、帚霉屬Scopulariopsis、鏈格孢屬Alternaria、彎孢屬Curvularia、聚單端孢屬Trichothecium、酵母屬Pichia、支頂孢屬Acremonium、葡孢霉屬Botryosphaeria、盤多毛孢屬Neopestalotiopsis、毛色二孢屬Lasiodiplodia、黑孢霉屬Nigrospora、殼囊孢屬Cytospora、未知菌屬。其中，青霉屬、鐮刀菌屬、木霉屬和支頂孢屬為淡色絲孢菌。

參考昆蟲物種優(yōu)勢度(di)的劃分標(biāo)準(zhǔn)，di>0.10為優(yōu)勢屬，0.01

表2 不同生境中土壤淡色絲孢菌及其他物種的優(yōu)勢度

2.3 昆明西山風(fēng)景區(qū)生境中土壤淡色絲孢菌群落多樣性從表3可以看出，土壤淡色絲孢菌在昆明西山風(fēng)景區(qū)6種不同生境中的物種豐富度存在較明顯差異，防護(hù)林生境中物種豐富度最高(18)，它包含了18屬，其次為山坡林豐富度(16)，菜田生境中物種豐富度最低(10)，而農(nóng)田、菜田、草坪和竹林生境的物種豐富度較接近。山坡林和防護(hù)林生境中土壤淡色絲孢菌的H′指數(shù)均大于2，而其他4個生境中的多樣性指數(shù)略低，但是均大于1.78。菜田的均勻度最大(0.864 5)，農(nóng)田的均勻度最小(0.694 9)，其他生境的均勻度非常接近。防護(hù)林土壤中多樣性指數(shù)、物種豐富度和物種數(shù)均最大，說明防護(hù)林人為干擾活動少、土壤物種穩(wěn)定；菜田土中物種豐富度和物種數(shù)均最小，說明人為活動和耕作方式等影響真菌的數(shù)量和種類。防護(hù)林、山坡林的H′指數(shù)均較大，說明這種生境的土壤中有機(jī)質(zhì)和腐殖質(zhì)等營養(yǎng)較為豐富，較適合真菌的生長與繁殖。草坪、竹林、農(nóng)田和菜田土真菌H′指數(shù)相對較低，說明其生境植被種類單一，可能會導(dǎo)致真菌數(shù)量和種類減少。從均勻度看出，菜田土真菌均勻度最大(0.864 5)，農(nóng)田土真菌均勻度最小(0.694 9)，其他類型的生境中真菌均勻度介于菜田土和農(nóng)田土之間，也較為相近。由表3可知，不同生境中淡色絲孢菌數(shù)量和物種數(shù)各不相同，說明淡色絲孢菌的數(shù)量與土壤結(jié)構(gòu)、營養(yǎng)成分等因素密切相關(guān)。

表3 不同生態(tài)類型土壤中淡色絲孢菌及其他物種的群落特征

2.4 昆明西山風(fēng)景區(qū)土壤淡色絲孢菌不同生境類型的群落相似性根據(jù)Jaccard相似性系數(shù)原理，當(dāng)相似性系數(shù)(Cj)為0～0.25時，為極不相似；當(dāng)0.25

表4 土壤淡色絲孢菌在不同生境類型的群落相似性

3 結(jié)論與討論

陸地真菌資源豐富，截至2000年，陸地真菌總數(shù)約5萬種[7-9]。該研究首次對昆明西山風(fēng)景區(qū)土壤淡色孢菌資源及其群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，共分離得到1 122株真菌，其中淡色絲孢菌726株，主要包含于鐮刀菌、支頂孢、青霉和木霉4個屬之中。這雖然初步揭示了該地區(qū)真菌種群的分布特征，但從數(shù)量和種類上講挖掘的遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。目前各個領(lǐng)域針對微生物菌群多樣性的分析方法主要分為培養(yǎng)法和非培養(yǎng)法2種，其中培養(yǎng)法由于條件限制只能分離鑒定出少數(shù)微生物。自然界中只有0.1%～1.0%的微生物通過常規(guī)方法能被培養(yǎng)，說明應(yīng)用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法導(dǎo)致了微生物多樣性的嚴(yán)重丟失。因此，非常有必要應(yīng)用非培養(yǎng)[10-12]的分子生物學(xué)方法來研究土壤中的真菌菌落組成，以此達(dá)到較為完整地獲取土壤中真菌多樣性信息的目的，同時也期望將來能找到一套更為科學(xué)的分離培養(yǎng)方法，從土壤中挖掘出更多的淡色絲孢菌。

生態(tài)學(xué)多樣性測定的局限性在于取樣地點和取樣本數(shù)量的局限性，在一個生態(tài)區(qū)域取樣時，只能按照統(tǒng)計學(xué)取樣要求進(jìn)行定點取樣，樣本數(shù)量雖然能夠反映出土壤中微生物的大部分信息，但是卻包含不了其中所有的種類。綜上所述，要想準(zhǔn)確分析土壤中淡色絲孢菌的多樣性，必須改進(jìn)真菌分離方法，采用多種手段相結(jié)合的方式對微生物多樣性進(jìn)行合理分析。