卵黃抗體在水產疾病防治中的研究應用進展

范賢平，蔣 葛，喬 毅，沈 輝*，徐軍田

(1.江蘇海洋大學海洋生命與水產學院，江蘇連云港 222000；2.江蘇省海洋水產研究所，江蘇南通 226007)

近年來，我國水產養殖業發展迅速，養殖產能長期處于世界首位。隨著高密度、工廠化、集約化養殖模式的建立和推廣，水環境污染、水生動物病害等問題已成為制約水產養殖綠色發展的主要瓶頸[1]。尤其抗生素等藥物的大量使用，造成了養殖生物大量藥物殘留、病原菌耐藥性增加、環境污染等嚴重問題[2]。因此，水產養殖行業急需安全、高效的抗生素替代品[3]。

IgY(immunoglobulin of yolk，IgY)又稱卵黃免疫球蛋白，因其具有特異性強、無毒副作用、制備方便、經濟優勢明顯等特點，已被廣大研究者所關注。近年來，該技術被廣泛用于水產養殖中，以治療某些水生動物的傳染病[4]。IgY技術在預防和治療水產細菌性方面取得了豐富的進展，如弧菌病、腐皮病、愛德華氏菌病、敗血病等。另外，針對水生病毒性疾病如蝦白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus，WSSV)、神經壞死病毒(nervous necrosis virus,NNV)、彈狀病毒(micropterus salmoides rhabdovirus，MSRV)等水生疾病方面也有研究報道。此外，該技術還應用于病原診斷和海鮮保存，豐富了IgY的研究應用。筆者總結了IgY的結構、優勢、作用機理等，綜述了近年來水產動物病害防治中IgY的應用，以期為IgY在水產動物病害防治中的深入研究和產業化應用提供理論基礎。

1 IgY基本特征

1.1 IgY的結構特點IgY分子的結構與動物免疫球蛋白G(IgG)相似，都具有兩條重鏈和兩條輕鏈，且呈Y字形排列。不同之處在于IgG的重鏈具有3個恒定區，且含有鉸鏈區，而IgY具有4個恒定區。此外，鉸鏈區的缺失使得IgY與IgG的抗原識別和結合能力不同[5]。IgY的等電點為pH 5.7～7.6，比IgG更疏水[5]。IgY的Fc片段與IgG不同，不會激活哺乳動物的補體系統[6]。同樣，IgY不與IgA、IgG或類風濕因子結合，從而避免了假陰性或假陽性結果的產生[5]。

1.2 IgY的優勢在IgY制備方面，少量的抗原刺激可引起蛋雞強烈的免疫反應，特異性抗體可以在蛋雞體內連續合成，抗體產生的周期較長。每枚蛋可收集100～200 mg IgY，成本較低[7]；同時避免了采血對動物的應激反應，符合動物福利的要求[8]。另外，抗體提取方式簡單，適合大規模生產，其化學性質穩定，有耐酸、耐堿、耐熱的特點[9]。IgY與抗生素相比，IgY具有療效高、作用快、不易產生耐藥菌和繼發感染等特點，對病原具有較強的特異性，無毒副作用，具有局部和快速吸收作用及更高的比活性，并且不會有有害物質殘留[10]。IgY在對大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[11]、鰻鱺(Anguillajaponica)[12]及中華鱉(Trionyxsinensis)[13]的病原防治過程中，除可有效抑制病原的侵染力外，還具有明顯的促生長作用。

2 IgY在水產細菌性疾病中的應用

目前，盡管研究者們開展了一系列研究，但仍尚未完全闡明IgY在疾病的預防和治療中的作用機制。據已有研究報道，IgY主要通過抑菌活性、凝集作用、黏附抑制、對細菌毒素中和作用，吞噬調理作用方式發揮中和保護效果。

IgY的抑菌活性主要歸因于IgY介導的細菌凝集作用[14-15]，細菌與特定IgY形成復合物，并在培養管底部沉淀形成小球，可能導致病原菌活動性下降，降低其自由獲取營養的能力，從而發揮抗菌作用[16-17]。有研究表明，特異性IgY以濃度依賴的方式抑制液體培養基中哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)[16]、遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)[17]、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)[15]、希瓦氏菌(Shewanellamarisflavi)[14]等的生長。Zhang等[16]通過觀察液體培養基濁度來測量特異性IgY對哈維氏弧菌生長的影響，結果顯示特異性IgY的濃度越高，作用效果越明顯，10 mg/mL特異性IgY的生長抑制作用與0.1 mg/mL鏈霉素相似(P>0.05)。此外，IgY在固體培養基上也表現出細菌生長抑制作用，說明特異性IgY的抑菌作用不僅有IgY介導的細菌凝集作用，還有一定的拮抗作用[16,18]。Xu等[17]對IgY與遲緩愛德華氏菌相互作用后的反應溶液組分進行分析，發現IgY能使菌體表面變得粗糙，細胞結構發生明顯變化，甚至使菌體細胞壁破碎，內容物溢出；MATH試驗結果證實，遲緩愛德華氏菌與特異性IgY相互作用后疏水性顯著降低17%，表明抗原與IgY結合可以破壞病原體的細胞壁和疏水性，直接阻礙病原體在感染部位的黏附和營養交換，從而還促進吞噬細胞的吞噬作用，降低體內致病性，該結果是對IgY的抑菌機制進一步補充。類似的結果在特異性IgY對希瓦氏菌[14]、燦爛弧菌(Vibriosplendidus)[19]的作用研究中也得到了印證。

此外，體內保護試驗顯示，特異性IgY能顯著降低在半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevi)[20]和香魚(Plecoglossusaltivelis)[21]血液、肝臟、脾臟和腎臟中鰻弧菌(Vibrioanguillarum)的數量。除降低病原菌數量外，IgY還可以提高血細胞對病原菌的吞噬活性[14,16-17]。特異性IgY可以顯著降低大菱鲆脾臟和頭腎中促炎細胞因子(IL-1β、IL-8、TNF-α)和補體C3的轉錄水平，有效緩解遲緩愛德華氏菌引起的炎癥反應，有助于避免炎癥細胞因子過度產生造成的組織病理學損傷[17]。抗遲緩愛德華氏菌特異性IgY還可以增強大菱鲆(Scophthalmusmaximus)頭腎巨噬細胞的吞噬活性，刺激大菱鲆非特異性免疫相關酶(LZM、SOD、POD)的產生，并增強這些酶的活性[22]。

一般來講，致病菌的蛋白毒素與細胞表面受體結合后內化進入細胞內，才能使細胞發生病變，而IgY與細胞表面受體或毒素蛋白結合，中和這些毒素，并減少毒素蛋白進入細胞來保護細胞的作用。近年來，一種新興的對蝦急性肝胰腺壞死綜合征(AHPND)給對蝦養殖造成巨大損失。該病原一般為一種攜帶一個69 kD(pVA1)質粒，可編碼PirA、PirB毒力蛋白的一類弧菌[23]。Nakamura等[24]開發了一種基于重組PirA毒素的特異性IgY，將10%高價抗PirA卵黃粉添加到飼料中，投喂3 d后IgY通過特異性結合并中和蝦消化系統中釋放的天然PirA毒素，與對照組相比，對蝦死亡率降低了75%。IgY在水產動物細菌性疾病中的應用見表1。

表1 IgY在水產動物細菌性疾病中的應用

續表1

3 IgY在病毒性疾病中的應用

IgY除了在細菌疾病中的應用外，在病毒疾病方面的防控也得到了廣泛的應用。研究發現，IgY可以抑制病毒顆粒的細胞間傳播，從而抑制病毒定植。寇海燕等[36]將卵黃粉稀釋液與CyHV-2混合后孵育鯉魚上皮瘤細胞(EPC)，結果顯示CyHV-2病毒解螺旋酶(Hel)基因表達水平分別下調60%，與空白對照組和陰性對照組差異極顯著，表明IgY具有較好的病毒中和作用，可顯著降低病毒量。一般來講，采用甲醛滅活完整病毒粒子，可以得到較好的免疫效果IgY[37]。盧亞楠[38]將抗-WSSV特異性卵黃抗體溶于鰲蝦飼養水中，結果表明，DNA疫苗特異性IgY組死亡率為80%，滅活WSSV疫苗IgY組死亡率降低至33.3%。從抗原選擇上，以DNA疫苗產生的特異性IgY免疫保護效果弱于滅活疫苗。盡管IgY對無脊椎動物不能直接激發其直接病原免疫作用，但可以引發其被動免疫。韋嵩等[39]連續投喂添加抗WSSV-IgY飼料20 d，發現凡納濱對蝦非特異性免疫因子(PO、SOD、ACP、UL)活性均顯著高于對照組。袁雪梅等[37]采用MSRV滅活疫苗免疫蛋雞，獲得抗MRSV-IgY，中和作用率達38%以上，病毒核酸拷貝數顯著降低，其凝集素在細胞內上調表達，表明其免疫作用被激活。IgY在水產動物病毒性疾病中的應用見表2。

表2 IgY在水產動物病毒性疾病中的應用

4 IgY在水產養殖診斷中的應用

IgY除抑制病原外，還具有病原診斷檢測能力。李思泉等[46]采用甲醛滅活柱狀黃桿菌免疫蛋雞獲得IgY，建立的間接ELISA方法檢測柱狀黃桿菌純培養液的檢出限值為1×107cfu/mL，與嗜水氣單胞菌、哈維菌無交叉反應，重復性好。另外，王帥兵等[47]以嗜水氣單胞菌主要致病因子Aer毒素和胞外蛋白酶(ECPase)作為免疫原制備IgY，與直接用嗜水氣單胞菌苗免疫制備的抗體相比，以Aer毒素和ECPase為免疫原獲得的抗體與不同來源菌株的致病因子間具有交叉反應性，克服了不同血清型病原菌對IgY免疫保護的影響，具有廣泛的適用性。

Young等[48]制備了抗針對太平洋鮭魚(Oncorhynchusspp.)微孢子蟲的特異性IgY。通過間接免疫熒光抗體試驗和免疫組化試驗檢測太平洋鮭魚各組織的感染。Zhang等[49]應用膠體金與抗全身性敗血癥球形病毒(STSSSV)特異性IgY結合開發了一種具有高靈敏度和特異性的一步免疫層析條，可在5～10 min內快速檢測甲魚肌肉組織和血清甚至糞便中全身性敗血癥球形病毒。IgY還能夠檢測水產品中有害物質。Campora等[50]利用雙抗夾心ELISA法檢測魚肉組織中的雪卡毒素，與軟海綿酸和軟骨藻酸無交叉反應性。

5 存在問題及展望

IgY作為一種安全綠色抗體制劑，被用于檢測各種病原體、預防治療各種疾病，取得了豐富的研究成果及較為理想的應用效果。然而，IgY的研究與應用還存在諸多問題。

首先，IgY對于機體的作用機制并不單一，而是多種作用機制共同作用的的結果，其作用機制仍需進一步深入研究。其次，IgY對革蘭氏陰性菌抑制與應用的報道較多，但針對革蘭氏陽性菌的研究報道較少，其作用機制還需進一步探索。再次，IgY抑制效果特異性還需要進一步加強，IgY從傳統的滅活病原至蛋白水平的特異毒力或結構蛋白為靶蛋白制備手段還需要對病原學進一步的協同，提高其特異性效果。最后，IgY防治技術和產品應用標準化規程尚未建立，使IgY作為水產養殖疾病防治產品而產業化開發具有一定的困難。但隨著研究的不斷深入，IgY在水產養殖疾病的防治、水產品的保鮮及病害的診斷等方面將有更好的應用前景。