線蟲模型在神經系統退行性疾病中的應用

呂 婧，李 瑤，吳 珂（通信作者），龔靖媛，姚 健，袁欣蕾，賈 茹

（廣州南方學院云康醫學與健康學院 廣東 廣州 510000）

神經退行性疾病（neurodegenerative diseases, NDs）是以神經元的功能和結構漸進性損害，甚至神經元死亡，而導致機體出現一系列功能障礙的一類疾病的統稱，包括阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）、帕金森病（Parkinson’s disease, PD）、亨廷頓氏病（Huntington disease, HD）、肌萎縮側索硬化（Amyotrophic lateral sclerosis, ALS）等，其中AD 和PD 分別為第1 和第2 大類神經退行性疾病，主要發生于中、老年人群。世界范圍內，NDs 發病率日益增多，隨著我國人口老齡化的加重，我國已成為NDs 發病人數最多、發病速度最快的國家。NDs 患者在晚期基本喪失自理能力，離不開家人的陪伴和照顧，對社會造成巨大影響和沉重負擔，但是現階段仍未開發出有針對性的藥物，已有的的藥物只能暫時減緩癥狀，不能治愈或阻止疾病進展，且NDs 發病機制尚未明確。為了解NDs 研究的最新進展，確定對中藥華桑相關實驗研究中所用的線蟲模型，本文對線蟲在NDs 實驗研究中常用的模型進行綜述。

1.線蟲模型在實驗研究中的優勢

1963 年，南非研究員SYDNEY BRENNER 首次將秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans, C. elegans）作為模式生物使用，至今已有50 余年的歷史，其優秀的生物學特點和低廉的價格奠定了其作為研究神經系統理想動物模型的地位。C.elegans 分雌雄同體和雄性2 種類型，可自體受精，也可雙性繁殖，通體透明，生存于土壤之中，以細菌為食，其結構簡單、生命周期短，易于培養，包含多種與人類相關的神經遞質，如乙酰膽堿、5-羥色胺、多巴胺、谷氨酸和神經肽等，且其在神經元中的合成、儲存和代謝等過程與哺乳動物具有高度相似性。C.elegans 也具有與大多數哺乳動物同源的離子通道基因。1998 年，線蟲的全基因組測序完成，成為第1 個完成全基因組測序的多細胞生物，推動了快速基因組學功能的研究，促進了目前廣泛使用的突變體線蟲daf-2、daf-9、daf-16 等的出現。目前研究者主要將突變體線蟲與野生型N2 線蟲（可發生自體繁殖）進行對照研究。通過線蟲模型，研究人員可以進行細胞編程死亡和遺傳控制、同源異形基因群（Hox-c）、神經生物學等研究。線蟲的研究熱點主要集中于可能導致疾病發生的幾種蛋白、基因模型，一般可以通過化學誘導或基因突變兩種方法獲取。

2.線蟲模型在AD 中的應用

AD 是一種進行性發展的神經系統退行性疾病，常見臨床癥狀包括記憶障礙、失語、失認、失用及性格行為改變等。由德國神經學家ALOIS ALZHEIMER 于1906 年首次在科學會議上報道。時至今日，該疾病的發病原因和機制仍不清楚，當前已做出的AD 發病機制猜想包括β-淀粉樣蛋白（β-amyloid, Aβ）級聯學說（胞外Aβ 的聚集形成老年斑）、tau 蛋白學說（tau 的過度磷酸化和錯誤折疊導致大腦神經纖維纏結）、神經膠質的過度激活、突觸功能障礙、神經炎癥、應激及神經網絡的破壞等。

2.1 Aβ 模型

家族性阿爾茨海默病患者腦組織細胞外過度產生的Aβ 可形成斑塊導致突觸功能障礙和神經元破壞，繼而在大腦皮質、海馬以及前腦等部位產生一系列病理改變，β 和γ 分泌酶可以降解β 淀粉樣前體蛋白（amyloid precurso protein, APP）形成Aβ，研究表明AD 主要是由于APP 基因突變導致Aβ 過度產生所致，然而腦組織Aβ 過度產生和異常沉積的發病機制不能完全解釋闡明AD 大部分散發病例。C.elegans 在試驗過程中需轉入人類的APP 基因，但是由于其缺乏產生分泌物的基因，所以無法產生細胞外Aβ，只能建立Aβ 基因模型，觀察細胞內Aβ 表達。METAXAS 等在此基礎之上，利用銅或鋅濃度失衡，觸發線蟲表達Aβ，為我們采用新的誘導條件進行線蟲造模提供了理論基礎。LINK 等利用轉基因線蟲的DNA 微陣列分析表明，幾種與人類同源的應激相關基因被上調，其中以Aβ 晶狀體蛋白基因（CRYAB）和腫瘤壞死因子誘導蛋白（TNFAIPI）基因這2 種為主，這些基因在去世的AD 患者腦中也被上調，說明即使C.elegans 是無脊椎動物，無法分泌Aβ，不能表現出與AD 相似的病理特征，我們也可以將C.elegans 細胞內Aβ表達與AD病理相關聯。LACKIE等在C.elegans Aβ 錯誤折疊模型中，下調熱休克蛋白（Hsp）家族里的Hsp90 及其伴侶基因，導致Aβ 毒性增加。

2.2 tau 模型

在AD 治療中，以Aβ 為靶點研發的藥物均以失敗告終，因此，研究者開始越來越關注AD 患者另一典型病理變化—微管相關蛋白tau 異常過度磷酸化。tau 蛋白的過度磷酸化促進tau 的過度聚集，繼而形成神經纖維纏結（neurofibrillary tangles, NFTs），具有神經細胞毒性。ZANIER 等在創傷性腦損傷（traumatic brain injuries,TBI）試驗中，利用C.elegans 作為生物傳感器來檢測TBI 產生tau 蛋白的致病作用，線蟲的運動依賴有效的神經肌肉傳遞，對淀粉樣蛋白的毒性異常敏感，通過對野生型和ptl-1（tau 蛋白同源蛋白）敲除線蟲的對比，證明tauTBI（創傷性腦損傷引起tau 蛋白異常形式）損害C.elegans 的運動活動和突觸傳遞，并支持tauTBI 在TBI 的長期后果中的致病作用。BENBOW 等構建了1 種轉基因C.elegans 模型，該模型同時表達人Aβ1-42 肽和tau 蛋白，通過引入tau 蛋白病理基因抑制因子，部分功能得到改觀，表明Aβ 和tau 在驅動AD 神經元功能障礙中具有協同作用。隨著研究深入，線蟲模型也不再局限于原始的Aβ 與tau 模型，而是進一步建立了雙轉基因模型，而該復合模型較上述單模型有明顯優勢。

3.線蟲模型在PD 中的應用

PD 是第2 大常見的神經系統退行性疾病，于1817 年被英國醫生JAMES PARKINSON 首次報道提出，其以運動障礙、靜止時手抖、肌強直和運動遲緩為主要臨床表現，可伴有嗅覺障礙、睡眠障礙等，該病以中腦黑質致密部多巴胺（dopamine, DA）能神經元變性死亡缺失為主要病理改變。現階段研究者認為PD 發病機制是遺傳因素、環境因素以及人口老齡化共同作用的結果，同時線粒體功能障礙和氧化應激等在PD 的發病過程中扮演重要角色。

3.1 α-Syn 模型

α-Synuclein（α-Syn）包涵體形成是PD 的特征性病理變化，作為構成大腦路易小體的最主要蛋白，α-Syn 在家族性和特發性PD 的發病中起著重要的作用。α-Syn 于腸道中產生，它們產生后從腸神經系統（enteric nervous system, ENS）向中樞神經系統（central nervous system, CNS）逐漸擴散，對大腦造成破壞，目前還不清楚這一過程在分子水平上是如何調控的。理論上，如果能夠清除腸道中的α-Syn 就可能改變帕金森病進程，但是目前仍無特定藥物可產生理想效果。研究人員已就PD 建立了相應的α-Syn 線蟲模型，在該線蟲模型身上表達α-Syn 后，施以不同腸道菌群并觀察其對α-Syn 表達的影響。AHN 等發現δ-分泌酶（天冬酰胺內肽酶，AEP）切割N103 處的α-Syn 和N368 處的Tau，并介導它們的活化和從腸道到大腦的逆行傳播，觸發與路易小體和運動功能障礙相關的黑質多巴胺能神經元丟失。α-Syn N103 和Tau N368 相互作用，在PD 患者的腸道和大腦中高度升高。查倩等使用魚藤酮誘導PD 線蟲模型，發現魚藤酮可致轉基因線蟲zcIs9;otIs181 線粒體損傷，破壞線粒體穩態，進而導致線蟲死亡及多巴胺能神經元功能的退化，使用多器官腫瘤綜合征（Von Hippel-Lindau, VHL）的抑制劑VH298，可以降低線蟲病死率，表明VH298 可以通過保護多巴胺能神經元，進而有效改善PD 線蟲模型運動行為的異常情況。

3.2 G2019S LRRK2 模型

在遲發性家族PD 中，LRRK2 基因突變是最常見的原因。目前研究表明，LRRK2 基因在多種細胞過程中的作用包括囊泡運輸、內吞作用、自噬等，但該基因的其他生物學功能仍有待進一步闡明。在家族性PD 中，LRRK2突變主要通過激酶依賴性機制在誘導神經元損傷。LRRK2 突變中，G2 019 S 是最常見的，由于實驗性哺乳動物模型成本高昂，而C.elegans 的價格低廉，且優點突出，在研究遲發性家族PD 時，研究人員利用線蟲構建了G2 019 S LRRK2 模型，采用該線蟲模型研究特定的生命調節途徑，通過核糖核酸干擾（RNA interference,RNAi）、構建AGE-1 轉基因和采用RT-PCR 技術，證明了由LRRK2（G2 019 S）誘導的年齡依賴性神經元損傷受不同的壽命延長途徑的廣泛調節，延長的壽命通常與多巴胺能神經保護相關，調節壽命延長的多種遺傳途徑具有神經保護作用。

4.展望

神經系統退行性疾病始終是人們關注的熱門話題，而線蟲模型因其獨特的優勢成為該類型疾病模式動物之一，隨著相關研究人員所建立的與線蟲相關模型的種類越來越多，神經退行性疾病的研究會進入更深層次，研究者可以在此基礎上進行多方位、多靶點、多系統的研究，以確認發病原因和機制，為特效藥物的開發打下基礎。相信在不久的將來，神經系統退行性疾病能夠取得突破性進展，減輕患者及家庭的痛苦和負擔。