RBF神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與癌細(xì)胞黏附度活性檢測(cè)研究

李 丹

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京醫(yī)院 南京市第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇省南京市 210003

細(xì)胞活性評(píng)估技術(shù)在抗癌新藥物測(cè)試[1]、細(xì)胞毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)[2]以及其他生化反應(yīng)刺激實(shí)驗(yàn)[3]中起著至關(guān)重要的作用。傳統(tǒng)細(xì)胞活性評(píng)價(jià)方法是細(xì)胞計(jì)數(shù)法[4]，即活細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)量的百分比。然而，由于細(xì)胞群體的異質(zhì)性，傳統(tǒng)的細(xì)胞計(jì)數(shù)法已經(jīng)不能滿足藥物劑量實(shí)驗(yàn)的精度要求。因此，如何評(píng)估細(xì)胞群體的異質(zhì)性問(wèn)題，是本論文需要解決的重要的科學(xué)問(wèn)題。眾所周知，細(xì)胞與其物理環(huán)境之間的黏附作用是發(fā)育生物學(xué)[5]、組織工程[6]與生物技術(shù)過(guò)程[7]中的核心，同時(shí)細(xì)胞黏附性還是細(xì)胞轉(zhuǎn)移[8]、細(xì)胞活性[9]以及細(xì)胞凋亡[10]的物理標(biāo)志，因此，細(xì)胞黏附強(qiáng)度被認(rèn)為是量化評(píng)估細(xì)胞狀態(tài)的重要物理指標(biāo)之一[11]。通過(guò)對(duì)細(xì)胞黏附性的檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞狀態(tài)無(wú)標(biāo)記、非侵入性與實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)，因此，本論文考慮將細(xì)胞黏附性作為評(píng)估細(xì)胞異質(zhì)性的方案。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、試劑與裝置 人胃癌細(xì)胞(SGC-7901)由南京第二醫(yī)院提供，培養(yǎng)基(DMEM+10% FBS)從美國(guó)Gibco公司購(gòu)買，細(xì)胞在37℃，5%CO2環(huán)境的水套式二氧化碳培養(yǎng)箱(購(gòu)買自Heal Force?)內(nèi)培養(yǎng)。30%濃度的H2O2與純度65%的順鉑[化學(xué)式：PtCl2(NH3)2]試劑購(gòu)買自MOLBASE公司；CCK-8細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)買自美侖科技公司。

離心機(jī)購(gòu)買自上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司，可調(diào)節(jié)旋轉(zhuǎn)角速度(ω<10 000rad/min)。微流控芯片由汶灝芯片技術(shù)有限公司(中國(guó)蘇州)制造，如圖1所示。離心式微流控芯片采用PDMS材料作為基材，含約105cells/ml細(xì)胞密度的培養(yǎng)基滴入芯片的入口，將芯片放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，使細(xì)胞在離心式微流控芯片的通道中黏附。

圖1 離心式微流控芯片的制作

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 首先將同一批培養(yǎng)的細(xì)胞樣本分為樣本A和樣本B，樣本A利用離心式微流控芯片進(jìn)行細(xì)胞黏附脫離實(shí)驗(yàn)，樣本B在96孔板中進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。兩個(gè)細(xì)胞樣本各自分為六組子樣本，分別用10μl不同濃度(0、10、50、100、200、500μmol/L)的H2O2培養(yǎng)3h，以建立細(xì)胞活性梯度，將滴入0μmol/L H2O2的樣本作為控制組。(1)細(xì)胞黏附脫離實(shí)驗(yàn)：通過(guò)改變芯片的轉(zhuǎn)速以改變貼附細(xì)胞所受離心力，弱黏附性的細(xì)胞會(huì)被較弱的離心力脫離，強(qiáng)黏附性的細(xì)胞會(huì)被較強(qiáng)的離心力脫離，從而建立細(xì)胞受離心力影響的黏附脫離動(dòng)力曲線圖。用Origin2016軟件對(duì)該曲線進(jìn)行Logistic擬合，得到S型函數(shù)f(x)。分別令f(x)=0.2、0.5、0.8，得到細(xì)胞黏附強(qiáng)度值τ20、τ50與τ80。(2)細(xì)胞活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)是用抗癌藥物順鉑進(jìn)行，將10μl不同濃度(0～300μmol/L)的順鉑試劑滴入96孔板中，培養(yǎng)24h，然后進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)；以順鉑溶液濃度作為x軸，以酶標(biāo)儀計(jì)算的細(xì)胞指數(shù)作為y軸制作藥物劑量反應(yīng)曲線圖(S型曲線)。用Origin2016軟件對(duì)該曲線進(jìn)行Logistic擬合，得到S型函數(shù)g(x)。令g(x)=0.5，得到細(xì)胞活性值IC50。(3)信息融合：將細(xì)胞多黏附強(qiáng)度值作為輸入，細(xì)胞活性值作為輸出，利用RBF神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立細(xì)胞活性預(yù)測(cè)模型。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均獨(dú)立重復(fù)20次，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即P<0.05(n=20)，其中P是指采樣誤差引起的樣品之間的差異。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞離心力 本文中利用離心力對(duì)群體細(xì)胞的異質(zhì)性等級(jí)進(jìn)行劃分，突破了傳統(tǒng)的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法評(píng)估細(xì)胞活性的弊端。如圖2所示，在離心式微流控芯片環(huán)形通道內(nèi)的細(xì)胞平均受力為[12]：

圖2 黏附細(xì)胞受離心力模型

其中，τ為細(xì)胞所受的離心力，r為細(xì)胞與芯片中心的距離，ρ為培養(yǎng)基的密度(998.5kg/m3)，μ為培養(yǎng)基黏度(0.085dynes·cm-2·s)[13]，ω為離心式微流控芯片旋轉(zhuǎn)的角速度。

2.2 細(xì)胞黏附強(qiáng)度信息提取 細(xì)胞在離心式微流控芯片環(huán)形通道內(nèi)培養(yǎng)貼壁，控制轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)速以改變離心力，每次持續(xù)12min，然后對(duì)環(huán)形通道內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，除去最初的細(xì)胞數(shù)量(控制組)得到細(xì)胞指數(shù)。將得到的數(shù)據(jù)用Origin2016進(jìn)行Logistic函數(shù)(S型曲線)擬合，得到圖3。其中Logistic函數(shù)表達(dá)式為：

圖3 不同活性梯度下離心力對(duì)細(xì)胞指數(shù)的影響

對(duì)圖3擬合的結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 Logistic函數(shù)擬合參數(shù)表

其中，所有擬合的確定系數(shù)(R-Square)均>0.99，同時(shí)校正確定系數(shù)(Adj.R-Square)也均>0.99，說(shuō)明圖3中的曲線達(dá)到了很好的擬合。

根據(jù)曲線的擬合，可以計(jì)算細(xì)胞的黏附強(qiáng)度。τN表示細(xì)胞脫離(100-N)%所受的離心力，以此來(lái)評(píng)估細(xì)胞群體的黏附強(qiáng)度。然而，用單一參數(shù)評(píng)估細(xì)胞群體的異質(zhì)性存在一定的誤差，因此，提取τ20、τ50與τ80等三個(gè)細(xì)胞黏附強(qiáng)度參數(shù)，并用RBF神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)來(lái)擬合輸出(細(xì)胞藥物反應(yīng)實(shí)驗(yàn))，以達(dá)到精確評(píng)估與預(yù)測(cè)細(xì)胞活性的目的，根據(jù)公式(2)、圖3與表1可計(jì)算出τ20、τ50與τ80等三個(gè)細(xì)胞黏附強(qiáng)度參數(shù)。

2.3 細(xì)胞活性標(biāo)定 提高細(xì)胞活性評(píng)估的準(zhǔn)確性，有助于提高新抗癌藥物的測(cè)試[1]，這也是細(xì)胞活性研究領(lǐng)域最重要的目標(biāo)之一。而細(xì)胞活性評(píng)估的標(biāo)準(zhǔn)方法，是用抗癌藥物對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行半抑制率(half maximal inhibitory concentration)IC50的測(cè)定[14]。這里，采用順鉑作為藥物反應(yīng)實(shí)驗(yàn)的試劑，順鉑主要應(yīng)用于SGC-7901等腫瘤細(xì)胞的治療[15]。用不同濃度的H2O2在96孔板中制備細(xì)胞活性梯度，然后進(jìn)行藥劑反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，順鉑濃度范圍為(1～300μmol/L)，得到藥物反應(yīng)曲線，如圖4所示。用Graphpad Prism 7.0軟件可直接計(jì)算出IC50的值，具體步驟為：(1)輸入數(shù)據(jù)，點(diǎn)擊analyze→ 點(diǎn)擊Transform concentration[x]；(2)選擇Transform to logarithms；(3)點(diǎn)擊analyze→點(diǎn)擊Dose-response-Inhibition→點(diǎn)擊Log(inhibitor)vs.response-Variable slope(for parameters)。利用該方法計(jì)算的IC50的值見(jiàn)表2，作為RBF神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸出。

圖4 藥物反應(yīng)實(shí)驗(yàn)

表2 IC50的計(jì)算

2.4 基于RBF神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞活性評(píng)估 將細(xì)胞黏附強(qiáng)度τ=[τ20、τ50、τ80]作為RBF神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入，將抗癌藥物反應(yīng)實(shí)驗(yàn)的IC50值作為RBF神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸出，調(diào)用MATLAB程序：net=newrb(X_train,Y_train, spread)，其中spread為徑向基函數(shù)的分布密度，這里使spread=1.5。應(yīng)用訓(xùn)練好的模型對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到圖5，并與傳統(tǒng)細(xì)胞計(jì)數(shù)方法進(jìn)行比較。

由于群體細(xì)胞的異質(zhì)性，以細(xì)胞數(shù)量作為評(píng)價(jià)細(xì)胞活性的方法會(huì)造成藥物反應(yīng)的巨大誤差。由圖5可知，細(xì)胞被不同濃度的H2O2弱化[16]，雖然還是活的細(xì)胞，但是其抗藥物的能力明顯降低。黏附強(qiáng)度作為描述細(xì)胞狀態(tài)強(qiáng)有力的物理參數(shù)，通過(guò)RBF神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)將三種黏附強(qiáng)度參數(shù)融合在一起，綜合評(píng)價(jià)細(xì)胞活性，使得細(xì)胞活性得到更精確的評(píng)估與預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，相比于傳統(tǒng)細(xì)胞計(jì)數(shù)法的平均誤差19.0%，基于多黏附強(qiáng)度信息融合方法與標(biāo)準(zhǔn)方法IC50法的誤差更小，平均誤差為1.8%，提高了17.2%，如表3所示。因此，本文提出的細(xì)胞活性評(píng)估方法，對(duì)抗癌新藥物測(cè)試、細(xì)胞毒理學(xué)試驗(yàn)以及其他生化刺激的劑量反應(yīng)試驗(yàn)具有重大意義。

圖5 細(xì)胞活性評(píng)估方法對(duì)比

表3 細(xì)胞計(jì)數(shù)法、信息融合法與IC50法比較

3 討論

細(xì)胞的黏附強(qiáng)度是細(xì)胞活性重要的物理標(biāo)志之一，我們制備一種離心式微流控芯片，通過(guò)施加不同離心力，同時(shí)用細(xì)胞計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)細(xì)胞脫離情況，得到細(xì)胞指數(shù)與離心力大小之間的曲線關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，受較大離心力脫離的細(xì)胞都是屬于特異性黏附，因?yàn)榉翘禺愋责じ郊?xì)胞的黏附狀態(tài)太弱，易被較弱的離心力沖走，因此表明該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)具有生物學(xué)意義。本文從細(xì)胞黏附脫離動(dòng)態(tài)曲線中提取三種黏附強(qiáng)度，表明此方法可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞群的黏附異質(zhì)性的評(píng)估，且提取的黏附強(qiáng)度參數(shù)越多，其表征細(xì)胞群黏附強(qiáng)度的梯度越精確。由于細(xì)胞所受離心力被位置所限制，因此離心式微流控芯片的通道寬度設(shè)計(jì)不能超過(guò)三個(gè)細(xì)胞的直徑，否則會(huì)造成黏附細(xì)胞受力不一致；同時(shí)，窄通道的設(shè)計(jì)也有利于細(xì)胞計(jì)數(shù)。另外，細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)能力不只體現(xiàn)在死活上，每個(gè)細(xì)胞活性狀態(tài)不一樣，因此存在活性異質(zhì)性問(wèn)題。結(jié)果表明，利用細(xì)胞群的多黏附強(qiáng)度信息評(píng)估細(xì)胞活性，相比于傳統(tǒng)僅以死活評(píng)價(jià)的細(xì)胞計(jì)數(shù)法，其評(píng)估細(xì)胞藥物反應(yīng)的精確度大大提高。

由于細(xì)胞黏附強(qiáng)度的提取需要細(xì)胞在微流控芯片中貼壁，貼壁時(shí)間大約12h，無(wú)法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞活性的快速提取，因此，未來(lái)我們將考慮利用縮窄微通道實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞黏附強(qiáng)度的高通量提取，以提升細(xì)胞活性評(píng)估的效率。另外，雖然本文提取了細(xì)胞的多黏附強(qiáng)度信息，但是仍然屬于單一的胞外物理特征，將來(lái)若結(jié)合電化學(xué)方法提取細(xì)胞膜電容性、胞質(zhì)濃度或細(xì)胞內(nèi)部電位等信息，并利用深度學(xué)習(xí)將之融合在一起，則可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞活性更加全面精準(zhǔn)的評(píng)估。