右美托咪定預處理對膿毒癥急性腎損傷大鼠腎功能、凋亡相關蛋白及Keap1-Nrf2/ARE信號通路的影響*

王傳福 朱 巖 劉麗麗 王 芳 劉忠濤 魏立林

黑龍江省佳木斯市中心醫院麻醉科 154002

膿毒癥極易引發急性腎損傷(AKI)，膿毒癥急性腎損傷(SA-AKI)可表現為尿量減少、氮質血癥、電解質紊亂等，嚴重者可繼發多器官功能障礙綜合征而增加病死率[1]。數據顯示，膿毒癥患者中AKI的發生率為30%～50%，且SI-AKI患者的病死率更是高達70.20%[2]。目前認為，SI-AKI的發生與腎臟低灌注、細胞的異常凋亡、Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1(Keap1)-核因子E2相關因子2(Nrf2)/抗氧化反應序列元件(ARE)信號通路的異常有關[3]。臨床上當前尚缺乏針對AKI的特效藥物，主要采取連續性腎臟替代治療，但預后仍欠佳。右美托咪定具有抗交感興奮、抗氧化、抗炎及抗凋亡等作用[4]。本文探討右美托咪定預處理減輕SI-AKI的作用機制，旨在為SI-AKI的治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實驗動物：成年SD大鼠30只，雄性，6周齡，體重250～300g(吉林大學基礎醫學院動物實驗中心)。(2)藥品、試劑及儀器：右美托咪定(江蘇華泰晨光藥業有限公司，國藥準字H20193382)；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒，TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒，血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)和尿酸(UA)ELISA檢測試劑盒[羅氏診斷產品(上海)有限公司]；B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、Nrf2、血紅素加氧酶-1(HO-1)、醌氧化還原酶1(NQO1)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)兔抗大鼠多克隆抗體(美國Bioword公司)；蛋白電泳儀(美國Biorad公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組及藥物處理：按照隨機數字表法將30只大鼠分為三組，各10只。右美托咪定預處理組在造模前10min，給予右美托咪定100μg/kg經耳緣靜脈注射，假手術組和模型組則注射等量生理鹽水，之后開始造模。

1.2.2 SI-AKI模型的建立：采用盲腸結扎穿刺術(CLP)建立SI-AKI大鼠模型，術前禁食不禁水16h，采用2%戊巴比妥鈉(60mg/kg)充分麻醉大鼠，備皮消毒后在下腹正中線做一長約1.50cm的切口，逐層開腹，分離并牽出盲腸，在盲腸根部予以3-0絲線結扎，并以直徑2.60mm的三棱針穿刺3孔，將少許腸內容物擠出后將盲腸回納腹腔，逐層縫合關腹。術后給予復方氯化鈉30ml/kg皮下注射行補液治療。假手術組只行開關腹手術，而無CLP手術。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 HE染色：取腎臟組織，PBS清洗后，置于4%多聚甲醛固定，經脫水、石蠟包埋后，制成5μm切片，經HE染色后，再次脫水、封片，在光學顯微鏡下觀察腎臟組織病理學改變。

1.3.2 腎功能指標檢測：于腹主動脈取血，以離心半徑13cm，3 000r/min離心15min，取血清，采用ELISA法檢測BUN、SCr和UA水平。

1.3.3 蛋白免疫印跡法(Western-blot)檢測腎臟組織蛋白表達：取-80℃各組大鼠腎臟組織100μl，加入RIPA裂解液 300μl，采用超聲破碎儀制備成組織勻漿后，以離心半徑10cm，3 000r/min離心10min，取上清液進行定量。經凝膠電泳分離蛋白，轉膜，封閉，TBST清洗后，依次加入一抗，孵育過夜，添加二抗，繼續孵育2h，曝光顯影，分析條帶灰度值。

1.3.4 TUNEL染色法檢測細胞凋亡：取腎組織做石蠟切片，經二甲苯清洗2次后采用梯度乙醇浸洗1次，參照TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒說明書，采用濃度為20mg/L的蛋白酶K工作液封閉組織20min，加入PBS清洗2次，并加入50μl的TUNEL反應混合液，37℃避光反應60min，采用DAPI復染10min后熒光顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 3組術后24h腎臟組織病理學改變 假手術組腎臟組織結構完整、清晰、無損傷；模型組腎臟組織結構完整度、清晰度下降，腎臟組織水腫嚴重，并伴有大量炎性細胞浸潤，腎小球變形、萎縮、塌陷，腎間質亦伴有大量炎性細胞浸潤，腎小管管腔狹窄；右美托咪定預處理組上述病變較模型組明顯減輕，見圖1。

圖1 3組術后24h腎臟組織病理學改變(HE染色，光鏡×40)

2.2 3組腎功能比較 右美托咪定預處理組血清BUN、SCr和UA水平高于假手術組，且低于模型組(均P<0.05)，見表1。

表1 3組腎功能比較

2.3 3組腎臟組織凋亡相關蛋白的表達和細胞凋亡率比較 右美托咪定預處理組腎臟組織Bax表達含量和細胞凋亡率高于假手術組，且低于模型組，而Bcl-2表達含量低于假手術組，且高于模型組(均P<0.05)，見表2。

表2 3組腎臟組織凋亡相關蛋白的表達和細胞凋亡率比較

2.4 3組腎臟組織Keap1-Nrf2/ARE信號通路相關蛋白表達含量比較 右美托咪定預處理組腎臟組織總Nrf2、核Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表達含量低于假手術組，且高于模型組(均P<0.05)，見表3。

表3 3組腎臟組織Keap1-Nrf2/ARE信號通路相關蛋白表達含量比較

3 討論

膿毒癥是由細菌毒素引起的急性全身炎癥反應，腎臟是膿毒癥最易受損的器官之一，由其導致的AKI每年在全球范圍內造成400萬以上人死亡，而存活者大多遺留認知功能障礙，具有病情兇險、病死率高的特點[5]。目前臨床主要予以抗感染、擴張血管、血液凈化、腎替代等治療SA-AKI，但預后仍不佳。因此，研究SA-AKI的病理生理學機制并尋找治療靶點意義重大。

右美托咪定可對位于腦和脊髓的α2腎上腺素能受體(α2-AR)產生激動效應而發揮抑制交感神經作用。此外，右美托咪定可抗交感興奮、抗氧化、抗炎及抗凋亡[6]。本研究行CLP造模后，模型組腎臟組織結構完整度、清晰度下降，腎臟組織水腫嚴重，血清BUN、SCr和UA水平明顯升高，提示建模成功，而在建模前10min給予右美托咪定預處理后，大鼠腎臟組織病理學明顯改善，血清BUN、SCr和UA水平明顯降低，與楊海榮等[7]的結果基本一致。提示，右美托咪定預處理可保護腎臟，可能是其能夠抑制去甲腎上腺素的釋放，進而可調節交感神經張力以及腎血管阻力，并可抑制血管加壓素分泌，改善腎血流，增加腎小球濾過率，產生利尿作用，從而保護腎功能。

凋亡是一種程序性細胞死亡，過度而失調的細胞凋亡是腎臟組織細胞死亡的主要方式，亦是引發SI-AKI的主要病理生理基礎，發生膿毒癥時凋亡相關因子Bax的表達含量上升，凋亡抑制因子Bcl-2的表達含量下降，進而造成腎臟細胞凋亡，引起腎臟損傷[8]。本研究結果顯示，右美托咪定預處理組腎臟組織Bax表達含量和細胞凋亡率高于假手術組，且低于模型組，而Bcl-2表達含量低于假手術組，且高于模型組。提示右美托咪定預處理能夠通過促進Bcl-2表達，并抑制Bax表達而對腎臟組織細胞產生有益的抗凋亡作用。

Keap1-Nrf2/ARE通路對于維持機體穩態具有重要作用。Nrf2可通過與Keap1、ARE相互作用而啟動下游Ⅱ相解毒酶、抗氧化蛋白和抗炎癥蛋白的基因表達，且其表達越高，細胞抗氧化、抗炎、抗理化損傷、抗細胞凋亡能力越強，具有理想的細胞保護作用[9]。Nrf2通路激活后可啟動下游HO-1和NQO1等基因的表達。HO-1和NQO1均屬于抗氧化、抗凋亡基因，其中，HO-1可催化血紅素釋放鐵形成膽綠素，發揮氧化損傷保護作用，并可通過上調抗炎因子IL-10來賦予其抗炎特性[10]；NQO1是一種調控ROS生成的抗氧化蛋白，對膿毒癥誘導的AKI具有保護作用。本研究結果顯示，右美托咪定預處理組腎臟組織總Nrf2、核Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表達含量低于假手術組，且高于模型組，提示右美托咪定預處理能夠促進Nrf2入核，可通過激活Keap1-Nrf2/ARE信號通路，增加HO-1和NQO1蛋白表達而減輕腎組織炎癥和氧化應激反應，抑制腎組織細胞凋亡，減輕腎臟損傷，改善腎功能。

綜上所述，右美托咪定預處理可通過激活Keap1-Nrf2/ARE信號通路，增加HO-1和NQO1蛋白表達而抑制腎組織細胞凋亡，有利于減輕SI-AKI，保護腎功能。