一株H1N1亞型豬流感病毒的分離鑒定與進化分析

李亮

（廣東省廣州市黃埔區動物衛生監督所，廣東廣州 510530）

豬流行性感冒（Swine influenza）簡稱豬流感，是一種豬急性高度接觸性傳染病，病原為正黏病毒科甲型流感病毒屬的豬流感病毒（Swine influenza virus,SIV）[1,2]。豬流感病毒主要通過呼吸道進行傳播，病豬主要表現為咳嗽、打噴嚏、流鼻涕等癥狀，發病較急，發病率最高可達100%，傳播速度較快并且與人流感密切相關，因此，豬流感對養豬業和公共衛生安全可造成嚴重威脅。

當前，豬群中主要流行的SIV分為H1N1、H3N2和H1N2，3種亞型，其中H1N1亞型SIV主要包括古典和禽源H1N1亞型SIV[2]。流感病毒具有極強的宿主識別特異性，通常流感病毒不會跨越種間屏障感染其他類型的宿主，但豬的呼吸道上皮細胞具有特殊的包容性，其同時擁有唾液酸α2,6和α2,3兩種受體，基于此，豬被認為是禽、人流感跨種間傳播的中間宿主，同時可作為不同流感病毒重組的混合器[3]。本研究通過分離到的人源豬流感病毒的遺傳演化、抗原性分析，為闡明豬在流感病毒跨種傳播提供了重要的病原學佐證。

1 材料和方法

1.1 樣品采集、動物病毒分離及試驗動物

2020年從廣州某豬場采集疑似流感癥狀豬的鼻拭子30份，通過常規方法接種9日齡SPF雞胚增殖病毒。試驗所用雞胚購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 病毒亞型的鑒定

利用RNA純化試劑盒（購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司）提取病毒RNA，并以Unin-12為引物，按照反轉錄酶AMV試劑盒（購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司）說明書反轉錄合成cDNA。用特異性的亞型鑒定引物（上海生工生物工程技術服務有限公司合成）通過PCR擴增鑒定病毒亞型。

1.3 全基因序列測定與分析

1.3.1 全序列測定

吸取收獲的病毒尿囊液200 μL，提取基因組并反轉錄成cDNA，以cDNA為模板，利用SIV H1N1亞型各節段特異性引物進行PCR（上海生工生物工程技術服務有限公司合成）擴增病毒各個基因區段，膠回收PCR產物，連接轉化后送上海生工生物工程技術有限公司測序。

1.3.2 病毒分子特征與遺傳演化分析

利用Lasergene軟件中的Seqman程序包組裝各基因片段序列，通過NCBI的blast窗口進行同源性檢索，用MEGA7.0繪制進化分析樹，通過對HA和NA基因片段對應的氨基酸序列分析，獲得該流感病毒的分子特征。

2 結果

2.1 病毒分離鑒定

通過特異的PCR鑒定分離到的病原，確認該病原為H1N1亞型流感病毒，對該病毒全基因組測序并進行生物學特性分析后，命名其為A/swine/Neimeng/03/2020（H1N1） （簡稱 SW/Neim/03/20）。

2.2 核苷酸同源性

通過NCBI的Blast窗口對SW/Neim/03/20病毒的8個基因片段進行同源性比對發現，除M基因、NS基因與人源SI病毒A/Swine/Fujian/0325/2008（H1N1）同源性最高，其余6個基因均與人流感病毒A/Dunedin/2/2000（H1N1）同源性最高，各基因同源性比對數據見下表（表1）。

表1 A/swine/Neimeng/03/2020（H1N1）相關基因核苷酸同源性分析

2.3 病毒序列分子特征分析

全基因測序顯示，SIV SW/Neim/03/20（H1N1）的HA基因組開放閱讀框有1 698個核苷酸，編碼565個氨基酸，NA基因開放閱讀框有1 413個核苷酸組成，編碼470個氨基酸。通過HA蛋白分子的特殊構象推測，前17個氨基酸為信號肽，整個HA蛋白分為326個氨基酸的HA1和222個氨基酸的HA2兩個亞單位組成，HA1和HA2由一個堿性氨基酸R連接，HA蛋白的裂解位點氨基酸基序為PSIQSR↓G，該基序不含多個堿性氨基酸，表明該分離的病毒與低致病性毒株氨基酸序列特征一致。

通過分析SW/Neim/03/20抗原表位特性發現，該毒株與經典型和類禽型H1N1 SIV比較，在HA1上的4個抗原表位（Sa、Cb、Sb、Ca）易變，每個表位均有多個氨基酸的變異（見表2），HA2部分的表位較為保守。HA氨基酸鏈上分布有10個潛在的糖基化位點，其中HA1 區分布在 27、28、40、71、104、142、176 和303等氨基酸位點，HA2區分布在氨基酸的497和556位點。SW/Neim/03/20毒株4個抗原表位（Sa、Cb、Sb、Ca）和潛在的 10個糖基化位點均和參考株A/Dunedin/2/2000（H1N1）所具有的狀態一致。SW/Neim/03/20毒株與SIV參考株中均具有NA蛋白完整的7個糖基化位點。其中，鏈接區有4個(N44、N58、N63和N68)，結構域有3個(N88、N146和N235)。

表2 分離株A/swine/Neimeng/03/2020（H1N1）和參考毒株HA1蛋白氨基酸序列比較

2.4 病毒HA和NA基因核苷酸系統進化分析

通過對分離毒株HA和NA基因進行系統進化樹構建與分析發現，分析的H1N1亞型豬流感病毒基因序列分為3個亞群，包括經典的H1N1，類禽的H1N1和季節性的H1N1人流感病毒。SW/Neim/03/20（H1N1）8個基因均與人流感亞群高度同源，該病毒沒有發生重組，并與2000年左右的人流感毒株A/Dunedin/2/2000（H1N1）進化關系最近（圖1、圖2）。

圖1 分離株和參考毒株HA基因進化樹

圖2 分離株和參考毒株NA基因進化樹

3 討論

豬的呼吸道上皮細胞具有特殊的包容性，其同時擁有唾液酸α2,6和α2,3兩種受體，基于此，豬被認為是禽、人流感跨種間傳播的中間宿主，同時，豬可作為不同流感病毒重組的混合器[4]。1998年，一株禽和人流感病毒的重組病毒曾在美國豬群中流行并引發大范圍流感；2009年3月的甲型H1N1流感病毒由墨西哥迅速傳到全球各地，對經濟和公共衛生造成嚴重損失，該病原同為重組SIV，其基因由禽源、人源及豬源流感病毒基因三重重配組成[5]。在我國近年相繼報道了多起人和豬流感重配病毒感染事件，這種重配的病毒與多基因型SIV在豬群中共流行，共流行提供了更多的病毒重組可能性[6]。人群和豬群通常缺少針對重配病毒相應的抗體，重組病毒往往會對其造成巨大損害。

在自然條件下，豬同時擁有唾液酸α2,6和α2,3兩種受體，因此，豬可以感染人流感病毒。人源流感病毒抗體在豬群內處于缺失狀態，這將導致人流感病毒更容易在豬群中流行，人源H3N2病毒多次感染豬群的情況，也證明了該觀點[5,7]。相對于H3N2病毒，人源H1N1在豬群中分離率較低，且缺乏持續進化證據可能是H1蛋白相對保守導致的[8]。經研究發現，SW/Neim/03/20（H1N1）的HA基因與A/Dunedin/2/2000具有99.51%的同源性，而 A/Dunedin/2/2000是2000到2007年期間北半球人流感中的代表病毒毒株。分離株與A/Swine/Fujian/0325/2008（H1N1） 以及參考株 A/Dunedin/2/2000的抗原位點完全一致，該相關性說明分離株SW/Neim/03/20（H1N1）通過人—豬傳播直接來自于人流感病毒，而非豬群進化而來。當前我國豬群遭遇各種重大疾病，與這些高致死、致殘性疾病相比，豬流感對養豬業的危害容易被輕視甚至忽略。在疫病診治過程中，豬流感常做為原發病誘發其他疫病對養殖業造成損害，而人源病毒在散發性的感染豬群，對豬致病性具有大流行的潛在危害，其與豬群中的其他病毒存在繼續發生重組的可能，再回傳到人群中，對公共衛生事業具有一定的潛在危害，需要持續監測與關注，防患未然。