HPLC法分析8%春雷霉素.噻霉酮懸浮劑*

包 娜，楊昌彪，馬 凱，廖朝選，段亞玲，龔會(huì)琴

(貴州省分析測(cè)試研究院，貴州 貴陽(yáng) 550002)

春雷霉素(Kasugamycin)，是一種高效、廣譜、低毒、無(wú)公害的氨基糖苷類(lèi)抗生素殺菌劑，是放線(xiàn)菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，具有極強(qiáng)的內(nèi)吸滲透性[1]，對(duì)細(xì)菌和真菌都有很好的預(yù)防及治療效果，廣泛用于水稻、瓜果、蔬菜等作物中的多種真菌和細(xì)菌性病害防治[2]。噻霉酮(Benziothiazolinone)，是一種新型、廣譜、高效的有機(jī)雜環(huán)類(lèi)殺菌劑，對(duì)細(xì)菌、真菌類(lèi)病害具有很強(qiáng)的抑制作用，具有低毒、低殘留，對(duì)環(huán)境安全等優(yōu)點(diǎn)，這兩種農(nóng)藥均可有效防治煙草野火病、水稻稻瘟病、柑橘潰瘍病、黃瓜細(xì)菌性角斑病等[3]，且田間藥效試驗(yàn)表明，二者混劑對(duì)番茄斑疹病的防治效果顯著高于單劑[4]。

目前春雷霉素和噻霉酮單劑的分析方法已見(jiàn)報(bào)道。春雷霉素單劑的分析方法主要有反相液相色譜法[5]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[6-7]、離子對(duì)反相液相色譜法[8-9]、高效毛細(xì)管電泳法[9]等。噻霉酮單劑的分析方法主要有液相色譜法[10-12]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-14]，還有研究采用了液相串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)該兩種化合物在柑橘中的殘留情況進(jìn)行了同時(shí)分析，但是該方法前處理麻煩、操作繁瑣，成本高，不適合制劑中有效成分含量的快速檢測(cè)，目前對(duì)懸浮制劑中該兩種化合物的有效成分進(jìn)行同時(shí)分析的方法研究還未見(jiàn)公開(kāi)報(bào)道。

試驗(yàn)建立了一種高效液相色譜法，可對(duì)8%春雷霉素.噻霉酮懸浮劑中的春雷霉素和噻霉酮同時(shí)進(jìn)行定量分析，此方法具操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確度和精密度高、分離效果好等優(yōu)點(diǎn)，可為產(chǎn)品的生產(chǎn)和質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1260 Ⅱ(具DAD檢測(cè)器)；色譜柱：ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm(id)，5 μm)；明澈超純水制備系統(tǒng)；超聲波清洗儀。

甲醇(色譜純)，磷酸(分析純)，春雷霉素鹽酸鹽標(biāo)樣(ω=87.9%)，噻霉酮標(biāo)樣(ω=99.57%)，超純水(電阻率18.2 MΩ·cm，25 ℃)，十二烷基硫酸鈉(分析純)、8%春雷霉素.噻霉酮懸浮劑(春雷霉素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，噻霉酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%)。

1.2 色譜操作條件及分析方法

檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm；進(jìn)樣體積：5 μL；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；運(yùn)行時(shí)間：15.0 min；流動(dòng)相：甲醇+水(0.2%十二烷基硫酸鈉，用磷酸調(diào)pH至2.5)=55+45(V/V)。

試樣溶液和標(biāo)準(zhǔn)混合溶液色譜圖見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 標(biāo)樣溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard solution

圖2 試樣溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of sample solution

1.3 標(biāo)樣溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取噻霉酮標(biāo)樣0.02 g(精確至0.0002 g)、春雷霉素鹽酸鹽標(biāo)樣0.05 g(精確至0.0002 g)于50 mL容量瓶中，用甲醇水混合液(體積比為1:1)溶解并定容至刻度，超聲5 min，冷卻至室溫，配成春雷霉素鹽酸鹽和噻霉酮的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

移取春雷霉素鹽酸鹽和噻霉酮的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5.00 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇水混合液(體積比為1:1)溶解并定容至刻度，搖勻，配制成春雷霉素鹽酸鹽和噻霉酮的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 計(jì) 算

將測(cè)得的2針試樣溶液及試樣前后2針標(biāo)樣溶液中的春雷霉素鹽酸鹽/噻霉酮峰面積分別進(jìn)行平均。2次平行測(cè)定結(jié)果相對(duì)偏差應(yīng)不大于2%，取其算數(shù)平均值作為結(jié)果。試樣中噻霉酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)按式(1)計(jì)算、春雷霉素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)按式(2)計(jì)算。

(1)

式中：W1為噻霉酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；A1為標(biāo)樣溶液中噻霉酮峰面積的平均值；A2為試樣溶液中噻霉酮峰面積的平均值；m1為噻霉酮標(biāo)樣的質(zhì)量，g；m2為試樣的質(zhì)量，g；P1為噻霉酮標(biāo)樣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

(2)

式中：W2為春雷霉素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；A3為標(biāo)樣溶液中春雷霉素鹽酸鹽峰面積的平均值；A4為試樣溶液中春雷霉素鹽酸鹽峰面積的平均值；m3為春雷霉素鹽酸鹽標(biāo)樣的質(zhì)量，g；m2為試樣的質(zhì)量，g；P2為春雷霉素鹽酸鹽標(biāo)樣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；379.36為春雷霉素相對(duì)分子質(zhì)量，g；415.82為春雷霉素鹽酸鹽相對(duì)分子質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 吸收波長(zhǎng)的選擇

采用DAD檢測(cè)器對(duì)春雷霉素和噻霉酮標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，分析其3D圖譜，試驗(yàn)結(jié)果表明春雷霉素和噻霉酮在190～260 nm均有較大吸收，綜合考慮溶劑吸收、雜質(zhì)干擾等因素的影響，將檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為215 nm，噻霉酮和喹啉銅的紫外吸收光譜圖見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 噻霉酮紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖Fig.3 The UV-Vis absorption spectrum of benziothiazolinone

圖4 春雷霉素紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖Fig.4 The UV-Vis absorption spectrum of kasugamycin

2.2 線(xiàn)性相關(guān)性實(shí)驗(yàn)

分別移取適量上述配制的春雷霉素鹽酸鹽和噻霉酮的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于10 mL容量瓶中，用甲醇水混合液(體積比為1:1)稀釋并定容至刻度，搖勻，配制系列梯度混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。在上述色譜操作條件下進(jìn)行分析，得到春雷霉素鹽酸鹽、噻霉酮的峰面積。然后分別以春雷霉素鹽酸鹽、噻霉酮標(biāo)樣溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以春雷霉素鹽酸鹽、噻霉酮標(biāo)樣溶液峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

試驗(yàn)結(jié)果表明：春雷霉素鹽酸鹽、噻霉酮的質(zhì)量濃度與峰面積之間的線(xiàn)性關(guān)系均良好，春雷霉素鹽酸鹽線(xiàn)性方程為y=4.96x+15.32，R2為0.9998；噻霉酮線(xiàn)性方程為y=22.25x-85.07，R2為0.9996，完全滿(mǎn)足試驗(yàn)要求。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

表1 精密度測(cè)定結(jié)果Table 1 Results of precision

從同一樣品中分別準(zhǔn)確稱(chēng)取0.4 g(精確至0.0002 g)試樣5份于50 mL容量瓶中，分別用甲醇水混合液(體積比為1:1)溶解并定容至刻度，超聲5 min，冷卻至室溫，過(guò)膜，備用。在上述色譜操作條件下進(jìn)行精密度測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

試驗(yàn)結(jié)果表明：春雷霉素變異系數(shù)為0.46%，噻霉酮變異系數(shù)為0.37%，該分析方法精密度良好，可滿(mǎn)足日常定量分析的要求。

2.4 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

表2 準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果Table 2 Results of accuracy

試驗(yàn)結(jié)果表明：春雷霉素的平均回收率為101.7%，噻霉酮的平均回收率為100.0%，該分析方法準(zhǔn)確度高，可滿(mǎn)足日常定量分析的要求。

3 結(jié) 論

試驗(yàn)建立了一種8%春雷霉素.噻霉酮懸浮劑中有效成分的分析方法。該方法可同時(shí)測(cè)定懸浮制劑中的春雷霉素和噻霉酮含量，其在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，方法的準(zhǔn)確度和精密度高，重現(xiàn)性好，具操作簡(jiǎn)單、快速、結(jié)果準(zhǔn)確、分離效果好等優(yōu)點(diǎn)，可用于生產(chǎn)過(guò)程質(zhì)量檢測(cè)與質(zhì)量控制。