基于網絡藥理學及數據挖掘分析生地黃-牡丹皮-甘草治療尋常型銀屑病的機制*

藺莉，閆小寧，李文彬，楊霄，張書嬋

（1.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中醫醫院，陜西 西安 710003）

銀屑病（psoriasis），亦稱牛皮癬，中醫稱之為白疕，該病為臨床常見的慢性皮膚病，發病機制復雜且易復發[1]。中醫學將致病因素分為外感、血熱、毒蘊三方面[2-4]。銀屑病發病以冬春最顯著，近些年發病率呈上升趨勢[5]。現代中醫學則主要將銀屑病分為血熱、血瘀、血燥3種證型[6]。

中醫學治療銀屑病處方思路獨具特色，并具有安全性高、療效佳等優點，根據中醫學的辨證論治原則，銀屑病在不同的發展階段有不同的臨床特點，應在不同發病階段采用不同的治療方法[7]。然而，由于臨床經驗的差異和中藥的復雜性，處方之間存在很大的差異。本研究基于數據挖掘的方法，從大量經過臨床證實有效的處方中挖掘出最核心的藥對，即生地黃、牡丹皮、甘草。其中生地黃、牡丹皮屬于清熱類藥物，均具有清熱涼血的功效，甘草是補虛類中藥，具有補脾益氣、清熱解毒、緩急止痛的功效。三藥配伍，共奏清熱涼血之功效，且三味藥物均具有抗炎、抗氧化等藥理作用。本研究運用網絡藥理學及分子對接的方法，對生地黃、牡丹皮、甘草的作用機制進一步探索，探討核心藥對治療尋常型銀屑病的主要活性成分及作用靶點，為臨床優化用藥和篩選新化合物提供依據。

1 資料和方法

1.1 數據來源 從CNKI數據庫中收集治療尋常型銀屑病的中藥處方。文獻檢索按主題、標題和摘要進行，搜索關鍵詞“中藥”或“中草藥”并“方藥”或“處方”并“尋常型銀屑病”；時間跨度從數據庫建庫至2021年3月5日。

1.2 納入標準（1）首次診斷為尋常型銀屑病；（2）口服中藥湯劑治療尋常型銀屑病的臨床研究；（3）處方應有效。以治療組與對照組療效相比是否具有統計學意義為界定標準。

1.3 排除標準（1）文獻綜述；（2）實驗研究；（3）未公布具體中藥處方或處方數據不完整。

1.4 數據分析 從符合條件的研究中提取出中藥處方，并建立數據庫。然后用SPSS軟件進行頻率分析。應用SPSS Modeler軟件進行數據結果可視化，運用Apriori建模進行關聯規則分析，從所有處方中識別出治療尋常型銀屑病的核心中藥組合。通過GEO數據庫整理找出尋常型銀屑病的差異基因，通過TCMSP、Batman-TCM數據庫檢索核心配伍的主要化合物成分和作用靶點，并在GeneCards數據庫、OMIM數據庫、DrugBank數據庫和Disgenet數據庫檢索尋常型銀屑病的相關靶點。將差異基因與尋常型銀屑病基因靶點與核心藥對組合靶點進行合并取交集，對核心藥物組合治療尋常型銀屑病的潛在作用靶標進行基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，使用Cytoscape軟件構建“疾病-藥物-活性成分-靶點”網絡圖和活性成分與疾病共同靶點的蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interactions，PPI）網絡，得出最具活性化合物及核心靶點后，通過Auto Dock工具（v.1.5.6）和PyMOL（v.2.3）制備受體和配體，然后通過Autodock Vina（v.1.1.2）進行對接驗證，評價配體與靶蛋白結合強度的親和力，用Pymol 2.3對對接構象進行了可視化分析并提供最佳構象。

2 結果

2.1 數據篩選 共獲得890項研究。根據上述納入和排除標準篩選，最終納入175項研究，并提取出治療方劑178首。參照2015年版《中華人民共和國國藥典》一部和《中藥學》對178首方劑中的藥物名稱進行統一。

2.2 處方用藥頻數及藥物功效分析 對中藥名稱進行規范化處理后，共提取出259種中藥，累計出現頻數2 076次，取用藥頻數在前10%的中藥作為高頻藥物，共27種（頻數≥18），累計頻數1 288次（占總頻數的62.04%）。單味中藥具體使用情況見表1，其中使用頻率最高的前五味中藥分別是生地黃（64.61%）、甘草（56.18%）、赤芍（50.56%）、牡丹皮（50.56%）、土茯苓（42.70%）。27味中藥主要以清熱藥為主，其次是活血化瘀藥、解表藥、補虛藥等。

表1 單味中藥的使用情況（頻數≥18）

2.3 高頻藥物藥性、藥味及歸經分析 27味高頻中藥的藥性主要以寒、溫、平為主，其中寒性占比最高，但未出現涼性及熱性；藥味主要以甘、辛、苦為主，其中苦味出現最多，未見酸性藥物；藥物歸經主要以肝經為主，占25.35%，其次是心經（21.13%）、胃經（12.68%）。（見圖1）

圖1 高頻中藥性味、歸經分布圖

2.4 基于關聯規則分析高頻中藥組方規律 應用SPSS Modeler軟件對高頻藥物（使用頻數≥18）進行關聯規則分析，藥物間關聯規則網絡見圖2，Apriori算法是關聯規則挖掘的經典算法，基于Apriori規則，設置支持度為20，置信度為80%，最大前項數為5，最終在178首方劑中提取出14個核心藥物組合，潛在藥物組合的提升度均大于1，具體參數見表2，說明這些藥物組合在統計學上差異均有統計學意義。其中置信度最高的組合是“生地黃-牡丹皮-甘草”。

表2 高頻藥物關聯規則組合

圖2 高頻中藥關聯規則網絡

2.5 核心藥物組合網絡藥理學機制分析

2.5.1 尋常型銀屑病差異基因、作用靶點及核心藥物組合活性成分、作用靶點收集 以“psoriasis vulgaris”為關鍵詞，檢索GEO數據庫，下載GSE7610（有機體：智人）的基因芯片數據原始文件，數據共26個樣本。樣本采用GPL96人類基因表達陣列平臺檢測，13例正常對照組，13例疾病組。以logFC與P值作為篩選條件，所篩選出的基因被視為有顯著差異表達基因，利用R語言軟件繪制火山圖及熱圖進行差異基因可視化。（見圖3）其中無顯著表達差異的基因標記為黑點，在尋常型銀屑病皮膚樣本中表達上調的差異基因標記為紅點，共有58個，下調為藍點，共115個。最終得出差異表達基因共173個。

圖3 尋常型銀屑病差異基因表達火山圖

“生地黃-牡丹皮-甘草”是核心藥物組合，在中藥系統藥理學數據庫和分析平臺TCMSP、Batman-TCM搜索三味中藥的生物活性化合物，無法在數據庫搜索到的中藥，通過文獻查找補充，并通過SwissTarget Predicition平臺預測化合物靶點。在TCMSP數據庫的基礎上，以口服生物利用度（OB）≥30%和藥物相似度（DL）≥0.18為篩選標準，根據藥物動力學參數（ADME），篩選出候選化合物。利用UniProt數據庫將所有目標名稱轉換成基因符號用于后續研究。并以尋常型銀屑病為搜索詞，查詢GeneCards數據庫、OMIM數據庫、DrugBank數據庫和Disgenet數據庫，將搜索結果合并，刪除重復序列，從而得出核心中藥和尋常型銀屑病之間的重疊目標，共得到1 075個尋常型銀屑病相關目標。將差異基因與尋常型銀屑病基因靶點與“生地黃-牡丹皮-甘草”藥物組合靶點進行合并取交集并制作Venn圖（見圖4），得到藥物組合與數據庫中尋常型銀屑病相關靶點、GEO差異基因的交集有108個。

圖4 疾病靶點及共同靶點Venn圖

2.5.2 “疾病-藥物-活性成分-靶點”網絡和PPI網絡分析 本研究構建了兩個網絡，均使用Cytosscape3.8.2構建圖解網絡，并利用網絡分析儀插件計算的網絡拓撲參數，用度值結合其他拓撲參數來描述網絡中節點的重要性，從而篩選出主要的生物活性化合物和目標。（1）“中藥-生物活性化合物-疾病治療靶點”網絡顯示了“生地黃-牡丹皮-甘草”、生物活性化合物和治療靶點之間的相互作用。該網絡由202個節點（3個中藥，91個生物活性化合物，108個靶標）和933條邊組成。（見圖5）91個生物化合物度值見表3，其中槲皮素及山奈酚的交互作用最明顯，槲皮素的作用靶點最多，度值為172，其次是山奈酚度值為70。表4顯示了最具交互作用的10個生物活性化合物的信息。（2）蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡顯示了治療靶點之間的相互作用。用檢索工具對治療靶點的PPI數據進行分析，以檢索相互作用的基因/蛋白質平臺（String），將物種確定為“智人”，最低置信度設置為0.9，根據PPI結果進行分析。結果顯示16個目標沒有參與蛋白質相互作用，最終的PPI網絡由92個節點和420條邊組成。（見圖6）對PPI網絡中的節點進行拓撲參數篩選，分別取Degree、Average Shortest Path Length、Betweenness centrality、Closeness centrality四項參數中位數，分別是7、2.527 472 53、0.004 839 895、0.395 652 17。以Degree值大于2倍中位數，其余各項參數參照中位數進行篩選，其中17個目標符合條件，是該網絡的主要指標。（見圖6）主要靶點與其他蛋白質廣泛相互作用，提示它們在尋常型銀屑病的發生、發展中起著重要的作用，其中STAT3、TNF及JUN三項占網絡中作用最突出，所以將其作為最具橋梁作用的靶點與核心化合物進行分子對接。

表3 生物活性化合物及其Degree值

表4 前10 個生物活性化合物及其參數

圖5 “藥物-生物活性化合物-疾病靶點”網絡圖

圖6 PPI 網絡及核心靶點條形圖

2.5.3 GO功能富集與KEGG通路富集分析 為了闡明核心中藥對尋常型銀屑病的治療機制，利用注釋、可視化和集成發現數據庫（DAVID）對108個治療靶點進行基因本體論（GO）功能富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）途徑富集分析。其中GO富集分析由細胞成分（CC）、分子功能（MF），生物過程（BP）三部分組成，結果數值P＜0.05和錯誤發現率（FDR）＜0.05被認為是顯著的，經過篩選后共得出266個BP條目，21個CC條目及40個MF條目。此外，106個KEGG途徑條目得到豐富，其中許多是特定類型癌癥的途徑。選取GO富集每項中前五項最顯著的條目，使用R軟件的“gg plot 2”軟件包繪制條形圖（見圖7），GO分析結果表明，對BP來說，主要以RNA聚合酶2啟動子轉錄正調控、基因表達正調控、藥物反應、炎癥反應、缺氧反應等條目為主，主要參與基因表達、轉錄及凋亡等的調控；對MF來說，靶點主要負責酶結合、相同蛋白結合及提高蛋白同源二聚化活性、細胞因子活性等；CC的靶點主要分布于胞外間隙、胞外區、細胞質、膜筏等。并選取前10項最豐富KEGG通路繪制氣泡圖（見圖8），由圖可見，KEGG通路主要以癌癥相關通路、TNF信號通路、乙型肝炎等通路為主。

圖7 GO 富集分析圖

圖8 KEGG 富集分析氣泡圖

2.6 核心化合物-核心靶點的分子對接驗證 為評估核心中藥的主要生物活性化合物與關鍵靶蛋白的結合勢，從蛋白質數據庫（PDB）下載STAT3、TNF、JUN 3種目標蛋白-原配體復合物的三維晶體結構，保存為“.pdb”文件，通過TCMSP數據庫查詢主要目標生物活性化合物的Pubchem ID，并通過Pubchem數據庫查詢目標生物活性化合物的三維分子結構，并以SDF格式保存，使用Open Babel 2.4.1將該格式轉換為“.mol2”格式。配體和受體是通過AutoDock工具（v.1.5.6）和PyMOL（v.2.3）制備的，制備受體的工作包括從受體晶體結構中刪除原配體和水分子，添加非極性氫，計算Gasteiger部分電荷，所制備的受體和配體均以pdbqt格式保存。

然后，用AutodockVina（v.1.1.2）評價配體與靶蛋白結合強度的親和力。親和力＜-5.00 kcal/mol表示結合強度好，親和力＜-7.00 kcal/mol表示結合強度令人滿意。兩個生物活性化合物與核心靶點的結合力見表5，用Pymol 2.3對對接構象進行了可視化和分析。（見圖9）

表5 槲皮素、山奈酚與STAT3、TNF、JUN 分子對接評分（單位：kcal/mol）

圖9 分子對接構象圖

3 討論

本研究主要分為兩個部分，以實現從臨床經驗到分子機制的推論。第一部分是通過數據挖掘從豐富的中藥處方中找出尋常型銀屑病的治療方藥。第二部分從網絡藥理學的角度推導了核心中藥對尋常型銀屑病的治療靶點和作用機理。首先，利用數據挖掘的方法，對中藥治療尋常型銀屑病的中藥處方進行分析，其中使用頻數最高的有生地黃、甘草、赤芍、牡丹皮、土茯苓等。對使用頻數排在前10%的27味中藥進行分析，統計其藥味、藥性及歸經。高頻藥物的藥性主要以寒、溫、平為主，藥味主要以甘、辛、苦為主，歸經主要以肝經為主。根據中藥的使用頻率和關聯規則，確定了生地黃-牡丹皮-甘草作為核心藥物組合，其中生地黃、牡丹皮屬于清熱類藥物，均具有清熱涼血的功效[8]，甘草是補虛類中藥，具有補脾益氣、清熱解毒、緩急止痛的功效[9]。中醫學認為白疕表現出的斑疹、脫屑為熱入血分的表現，往往從血瘀、血熱、血燥立法選方，清熱涼血類中藥在治療尋常型銀屑病時常被選擇。隨著對白疕的認識與治療經驗的豐富，情志因素對銀屑病發展的影響被越來越重視，而肝主情志，在疏達氣機方面起著至關重要的作用，因此肝經藥物在治療銀屑病中使用頻率較高[10]。

通過從GEO數據庫收集關于尋常型銀屑病的數據集，篩選出差異基因并進行分析，與PV疾病數據庫收集靶點及生地黃-牡丹皮-甘草的靶標進行合并并取交集，得到的重疊目標被認為是潛在的治療目標。對重疊目標進行GO和KEGG功能富集分析，結果表明，治療靶標可能主要參與基因表達、轉錄及凋亡等的調控。涉及的信號途徑主要包括TNF信號通路及其他與腫瘤相關通路等。其中腫瘤壞死因子（TNF）是銀屑病發病的重要炎癥細胞因子[11]。

本研究結果表明生地黃-牡丹皮-甘草藥對共有91個生物活性化合物，對Degree值排名前十的活性成分進行分析。主要的生物活性化合物是類黃酮，已有研究證實槲皮素、山奈酚、刺芒柄花素、柚皮苷、甘草查爾酮A等黃酮類化合物具有明顯的抗銀屑病作用[12-13]，這些化合物具有誘導細胞凋亡、抗炎和抗氧化的作用。其中，槲皮素具有抗炎、抗氧化、舒張血管、保護肝臟和抗癌等藥理作用[14]，其作用機制可能與改善抗氧化和抗炎狀態及抑制NF-κB信號通路的激活有關。山奈酚是一種天然的黃酮醇，具有很強的抗炎、抗氧化和抗癌作用[15]，可以減少牛銀屑病病變中CD3+T細胞的浸潤及主要促炎性細胞因子（IL-6、IL-17A和TNF-α）的基因表達。此外，山奈酚還能下調皮膚中的促炎性核因子κB（NF-κB）信號。刺芒柄花素同樣具有抗炎的作用[16]。柚皮苷是一種具有3個羥基部分的黃烷酮類似物，可以抑制IL-6過表達，達到基線控制。此外，柚皮苷還具有免疫調節，抗炎作用，可以降低銀屑病患者hPBMC中的mRNA表達和所有促炎細胞因子的產生[17]。甘草查爾酮A可以誘導ROS的形成并具有抗氧化作用。

核心藥對的活性成分共對應273個靶點，與尋常型銀屑病相關基因靶點及GEO差異基因的交集有108個。其中STAT3、TNF、JUN、AKT1、TP53等被確定核心藥對治療尋常型銀屑病的主要目標，并在PPI網絡中作出了重要貢獻，其中信號轉導與轉錄激活因子3（STAT3）是一種重要的轉錄因子。該因子介導了大多數參與銀屑病發病的細胞因子的信號，包括白細胞介素（IL）-23/IL-17/IL-22軸，在角質形成細胞過度增生與異常分化、與炎癥細胞相互作用、真皮血管增生等重要病理過程中起關鍵作用[18]。TNF可以促進人HaCaT和正常人表皮角質形成細胞（NHEK S）的促炎因子IL-6、CXCL 8和VEGF表達，還可以通過mTOR信號刺激皮膚炎癥[19]。JUN是二聚體轉錄因子復合物AP-1的核心成員，對表皮生長因子受體（EGFR）表達有直接轉錄作用，角質形成細胞中AP-1的下調可誘發銀屑病。JUN可作為表皮生長因子受體（EGFR）表達過程中角質形成細胞增殖/分化的正調節因子，從而起到治療銀屑病的作用[20]。Akt1可以促進亞型絲氨酸473磷酸化的上調，導致高濃度CCL 3通過K48鍵泛素化促進FOXP3降解，從而降低FOXP3的穩定性。CCL 3-mTORC2亞PKB/Akt1S473磷酸化軸在FOXP 3+Tregs中具有重要作用，能促進銀屑病的發生發展[21]。Tp53對銀屑病治療的調節因子-1具有促凋亡功能，P53蛋白在細胞增殖調控中起著重要的作用[22-23]。

綜上所述，本研究通過數據挖掘對中藥治療尋常型銀屑病的處方進行分析與關聯規則建模，從而得出生地黃-牡丹皮-甘草這一核心中藥組合，并利用網絡藥理學方法推導了核心中藥對尋常型銀屑病的治療靶點和作用機理。研究表明生地黃-牡丹皮-甘草可以通過槲皮素、山奈酚等類黃酮活性成分單體發揮誘導細胞凋亡、抗炎和抗氧化作用，通過STAT3、TNF等信號通路發揮對尋常型銀屑病的治療作用。最后，對最具活性生物化合物（槲皮素、山奈酚）與STAT3、TNF及JUN三項最具橋梁作用的靶點進行了分子對接模擬，對接結果表明2種活性化合物均與STAT3、TNF、JUN緊密結合，從而為其發揮藥理作用提供了佐證，但仍需進行實驗驗證來進一步證實這一結論。