射干炭納米類成分的發現及其保肝作用的研究*

李郁茹，趙亞芳，陳玉民，常閏然，田雨，張盈，羅娟，孔慧，趙琰，屈會化

（1.北京中醫藥大學中藥學院，北京 100029；2.北京中醫藥大學中醫學院，北京 100029；3.北京中醫藥大學中醫藥研究院，北京 100029）

肝臟是許多生理過程的關鍵樞紐，具有代謝、解毒和造血等多種重要的功能[1]。當發生損傷時，為了保障人體功能的正常運行，需要快速有效地修復該器官的損傷。急性肝損傷（acute liver injury，ALI）通常由病毒或細菌感染、化學毒物、藥物中毒、給藥不當等原因引起[2]，臨床表現為急性肝功能障礙[3-4]。若不能及時清除病因或給予適當的藥物治療，可繼而發展為急性肝性腦病[4]，該病具有預后差、死亡率高等特點[5]。臨床上用于預防和治療肝臟疾病的藥物多為化學合成藥物，如皮質類固醇、干擾素等。這些藥物存在價格高、不良反應大等問題[4,6]。因此，開發一種安全、有效的防治急性肝損傷的藥物具有重大意義。

納米顆粒（nanoparticles）為現今研究的熱點之一。碳點是納米顆粒中一類粒徑在1～10 nm之間的類球形顆粒，因具有高水溶性、低毒性、良好的生物相容性[7]等特點，其在藥物傳送[8]、熒光探針[9]、生物成像[10]、抗菌[11]和抗病毒[12]等諸多領域中廣泛應用。碳點的制備方法“高溫熱解法”與炭藥的制備方法“高溫炭化法”有異曲同工之妙?；诖?，本團隊將納米研究技術和方法引入到中藥炭藥的研究中并從多種炭藥中分離出了類似于碳點的物質，將其命名為“納米類成分（nanocomponents）”。進一步的研究發現，不同炭源和制備條件所制備出的納米類成分由于粒徑、官能團等性質的差異而具有不同的生物活性，如石榴皮炭納米類成分具有止瀉作用[13]，甘草炭納米類成分具有抗應激性胃潰瘍作用[14]，牡丹皮炭納米類成分具有涼血止血作用[15]，枳實炭納米類成分具有抗痛風作用[16]等。這為中藥炭藥的研究提供了一種全新的思路。

射干（Belamcandae Rhizoma，BR），為鳶尾科射干屬植物射干Belamcanda chinensis (L.)DC.的干燥根莖，始載于《神農本草經》[17]。射干的燒制最早載于《金匱要略》鱉甲煎丸方，用以治療癥瘕積聚、久瘧瘧母等疾病[18]。經文獻考證，仲景時期的“燒”實則為“燒灰存性”[19]?！盁掖嫘浴睘橹兴幹铺康牡谝粋€炮制質量標準[20]。鱉甲煎丸條文中記載的射干“燒”實則為射干炭。現代研究表明，鱉甲煎丸在臨床上常用于肝炎、肝纖維化、肝癌等肝系疾病的治療[21]。為了探索原方中射干的炮制內涵，本研究基于前期的研究基礎，首次利用射干作為前驅體，采用高溫熱解法制備出了一種新型的納米類成分——射干炭納米類成分（Belamcandae Rhizoma Carbonisatum nanocomponents，BRC-NCs），并利用透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）、紫外-可見分光光度法（ultraviolet-visible spectrophotometer，UV-vis）、傅里葉變換紅外光譜（fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）、熒光光譜和X-射線光電子能譜分析（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）對其進行了表征分析。此外，本研究利用CCl4所致急性肝損傷的動物實驗來研究其對于肝臟的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 5周齡SPF級健康雄性昆明小鼠42只，體質量（30.0±2.0）g，動物質量合格證編號：No.110324201104285675，實驗動物均購于斯貝福（北京）生物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2019-0010。實驗期間小鼠均飼養于同一環境下，保持室溫（24.0±1.0）℃，空氣濕度55%～65%，環境安靜，小鼠自由進食進水，明、暗12 h循環飼養。本實驗中小鼠均為脫頸處死，實驗操作符合一般動物實驗倫理學原則，經醫學實驗動物管理委員會批準。

1.2 藥物與試劑 射干（批號：190628003），經北京中醫藥大學趙琰教授鑒定，為鳶尾科植物射干Belamcanda chinensis（L.）DC.的干燥根莖，采購于北京仟草中藥飲片有限公司，生產日期為2019年6月28日；聯苯雙酯滴丸（規格：1.5 mg，批號：H11020980）購于北京協和藥廠；生理鹽水（批號：SD21022717）購于山東華魯制藥有限公司；四氯化碳（CCl4）溶液（批號：KYGG943）購于北京伊諾凱科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒（批號：20210407）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒（批號：20210408）購于南京建成生物工程研究所；本實驗用水均為去離子水。

1.3 主要儀器 PXR-9馬弗爐（北京中科奧博科技有限公司）；PFT-100A高速萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；HH-1水浴鍋（金壇市華城開元實驗儀器廠）；Tecnai G220低分辨透射電子顯微鏡（美國FEI公司）；RE-52AA旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；JEN-1230高分辨透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）；Escalab 250Xi X射線光電子能譜分析儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；F-4500熒光分光光度計（日本Hitachi公司）；CECIL紫外分光光度計（英國Cambridge公司）；傅里葉轉換紅外光譜儀（美國Thermo-Nicolet公司）；AU480全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）；Leica RM 2016石蠟切片機（美國萊卡公司）。

1.4 BRC-NCs的制備 稱取射干生藥70 g放入坩堝中，用鋁箔紙密封加蓋后放入馬弗爐中燒制。馬弗爐的程序升溫：第一階段通過5 min升溫至70 ℃，保留30 min；第二階段通過25 min升溫至400 ℃，保留1 h。待溫度降至100 ℃以下取出坩堝，放置到室溫。將燒制好的射干炭放入粉碎機中粉碎。稱取炭粉50 g，用30倍去離子水煎煮3次，每次1 h。用濾紙粗濾，再用0.22 μm微孔濾膜精濾，合并3次濾液，濃縮，濃縮液用1 000 Da透析膜透析72 h，每4 h換水1次，取透析袋內溶液于4 ℃冰箱中留存，待用。

1.5 BRC-NCs的表征 用透射電子顯微鏡對BRC-NCs的微觀結構進行分析。將制備好的BRC-NCs透析液倍比稀釋后，用0.22 μm的微孔濾膜濾過，超聲分散2 h，滴在銅網上，自然干燥。將銅網放于TEM顯微鏡下，選取合適的視野范圍，觀察其微觀結構。將BRC-NCs透析液稀釋至合適的濃度后，吸取2 mL于石英比色皿中，置紫外分光光度計內，在200～600 nm下對樣品進行掃描。吸取上述樣品2 mL于石英比色皿中，置熒光分光光度計內，以1 200 nm/min掃描。精密稱取160 mg溴化鉀粉末后放入瑪瑙研缽中，加入BRC-NCs透析液20 μL，置紅外燈箱中烘干、研勻，壓片，放入傅里葉變換紅外光譜儀中進行檢測。

1.6 BRC-NCs元素分析 吸取50 mL BRC-NCs透析液滴于蒸發皿中，將蒸發皿放在水浴鍋上烘干。待其完全干燥后用藥匙輕輕刮取粉末，均勻鋪在鋁箔上，蓋上一片鋁箔，液壓機壓平后置X射線光電子能譜分析儀中進行測試。

1.7 熒光量子產率的計算 以硫酸奎寧[22]為參照物，通過以下公式計算BRC-NCs的熒光量子產率：

其中，“I”為發射光譜下的峰下面積，“A”為350 nm下的吸光度值，“η”為溶劑的折射率。“NCs”為BRC-NCs，“R”則代表標準品。熒光光譜掃描時，激發波長（λx）的狹縫寬度為10 nm，發射波長（λm）的狹縫寬度為5 nm。為了使重吸收效應最小化，其中AR和ANCs應在0.05以下。

1.8 藥物的配制

1.8.1 BRC-NCs溶液的制備 取上述透析過后的適量BRCNCs溶液凍干后精密稱取BRC-NCs粉末，加入適量去離子水配制成質量濃度為1 mg/mL的BRC-NCs備用。

1.8.2 陽性藥的配制 取聯苯雙酯滴丸196粒，規格為1.5 mg/粒，加入19.6 mL的去離子水，配制成質量濃度為15 mg/mL的聯苯雙酯溶液。

1.8.3 造模藥的配制 四氯化碳溶液與橄欖油溶液按1∶9的體積比例混合均勻，即得。

1.8.4 麻醉劑的配制[23]精密稱量8.0 g水合氯醛粉末，倒入具塞三角瓶中，加入200 mL去離子水配制成4%的水合氯醛溶液，震蕩完全溶解，備用。

1.9 動物分組及給藥 42只SPF級健康雄性昆明小鼠隨機分為6組，分別為正常組、模型組、BRC-NCs高劑量組（5mg/kg）、BRCNCs中劑量組（2.5 mg/kg）、BRC-NCs低劑量組（1.25 mg/kg）、聯苯雙酯組（150 mg/kg），每組7只。灌胃體積為0.1 mL/10 g[24]。BRCNCs的給藥劑量按照成人用藥劑量[25]換算成小鼠用藥劑量（以BRC的質量計算）后，結合前期預實驗篩選所得。實驗方法如下[26]：BRC-NCs高、中、低劑量組和聯苯雙酯組小鼠灌胃相應藥物，正常組和模型組灌胃給予等體積生理鹽水，1次/d，連續給藥7 d。末次給藥2 h后，除正常組外，其余各組小鼠分別腹腔注射10%的CCL4橄欖油溶液制備急性肝損傷模型，正常組腹腔注射等體積的橄欖油。

1.10 觀察指標

1.10.1 肝組織病理學觀察 取肝右葉，用體積分數為4%的多聚甲醛溶液固定后，常規石蠟包埋、切片，HE染色，在光學顯微鏡下觀察肝組織切片的病理學變化。

1.10.2 生化指標的測定 造模后的小鼠禁食不禁水，于16 h后摘眼球取血，常溫靜置4 h后置離心機中，3 000 r/min離心10 min，取血清，測定丙氨酸氨基轉移酶（alanine transaminase，ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、直接膽紅素（direct bilirubin，DBIL）、間接膽紅素（indirect bilirubin，IBIL）的活性。將采血后的小鼠麻醉后脫頸椎處死，取肝組織0.5 g，用生理鹽水漂洗后，用濾紙吸干水分，冰浴勻漿后離心，取上清液測定SOD、MDA的含量。

1.11 統計學方法 采用SPSS 25.0軟件進行統計分析。計量資料以“均數±標準差”（）表示。多組間數據的比較當方差齊時，采用單因素方差分析，方差不齊時采用非參數檢驗。組間比較，采用LSD法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BRC-NCs表征結果 在低分辨透射電鏡下觀察發現，BRC-NCs為類球形且分散性良好，分布均勻。其粒徑分布在1～7 nm之間，主要集中在4.0 nm左右。高分辨透射電鏡觀察結果顯示，BRC-NCs晶格清晰，間距為0.263 nm。

2.2 光學特征和結構分析 BRC-NCs紫外光譜顯示，在220 nm左右有微弱的紫外吸收峰，這可能是由于π-π*躍遷所引起的。熒光圖譜顯示，BRC-NCs的最大激發波長在350 nm左右，最大發射波長在446 nm左右。以硫酸奎寧為參照，計算其量子產率為1.62%。紅外光譜結果顯示，BRC-NCs的紅外吸收峰分別為3 442.94 cm-1、1 635.93 cm-1、1 384.30 cm-1。分析可知，3 442.94 cm-1峰可能為-O-H鍵，1 635.93 cm-1的吸收峰可能為-C=O鍵，1 384.30 cm-1強吸收表示可能為-C-N鍵。紅外光譜結果表明BRC-NCs表面含有羰基、羥基等官能基團。（見圖1）

圖1 BRC-NCs 的表征結果

2.3 元素組成和表面官能團分析 利用XPS法對BRC-NCs元素組成和表面官能團進行分析。結果顯示，在284.32 eV、399.22 eV、531.22 eV有3個峰，表明BRC-NCs主要由C、O和少量N元素組成。樣品中碳的含量為67.46%，氧的含量為28.59%，氮的含量為3.95%。在XPS高分辨率圖譜中，C1s譜帶顯示有284.7 eV、286.3 eV、288.1 eV三個峰，分別對應于C-N[27]、C-O[28]、C=O[29]。O1s譜帶顯示有531.27 eV、532.66 eV兩個峰，分別對應于C-O、C=O[23,30]。N1s譜帶顯示有399.5 eV、400.3 eV兩個峰，分別對應于C-N、（C）3-N[31-32]。（見圖2）

圖2 BRC-NCs 的XPS 分析結果

2.4 各組小鼠肝組織病理學改變情況 HE染色結果顯示，正常組小鼠肝組織結構正常，肝細胞無壞死、排列整齊，大小均勻，以中央靜脈為中心呈放射狀排列，細胞核位于細胞中央，圓整、邊界清晰，肝小葉結構完整；模型組小鼠肝組織損傷嚴重，肝索排列紊亂，肝組織可見廣泛彌漫性炎癥細胞浸潤，肝細胞排列紊亂，細胞結構被破壞，胞質空泡化等病變。與模型組比較，聯苯雙酯組小鼠肝組織結構大致恢復正常態，組織結構相對完整，肝小葉結構大致恢復正常態；BRC-NCs高、中、低劑量組小鼠肝組織損傷較輕，結構大致恢復正常，肝細胞排列較為整齊，炎癥細胞浸潤現象減輕，肝細胞壞死、變性情況明顯降低，肝索逐漸恢復，肝損傷情況有所改善。（見圖3）

圖3 各組小鼠肝組織病理學改變情況（HE,×200）

2.5 各組小鼠血清ALT、AST、DBIL、IBIL含量比較 與正常組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST、DBIL、IBIL含量均明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，聯苯雙酯組和BRC-NCs高、中、低劑量組小鼠血清中ALT、AST、DBIL、IBIL含量均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。結果表明，BRC-NCs對CCl4所致的急性肝損傷有明顯的保護作用。（見圖4）

圖4 各組小鼠血清ALT、AST、DBIL、IBIL 含量比較（，n=7）

2.6 各組小鼠肝勻漿中SOD活力及MDA含量比較 與正常組比較，模型組小鼠肝組織勻漿中的SOD活性明顯降低（P＜0.01），MDA含量明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，聯苯雙酯組和BRC-NCs高、中、低劑量組小鼠肝組織勻漿中SOD活性明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），MDA含量明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。結果表明，BRC-NCs能夠升高急性肝損傷模型小鼠肝臟組織中SOD的活性，降低MDA的含量。（見圖5）

圖5 各組小鼠肝勻漿SOD 活力及MDA 含量比較（，n=7）

3 討論

多年來，研究者們往往從小分子化合物的角度去闡述中藥炭藥高溫炭化后藥效改變或增強的機制[33]，然而結果并不令人滿意。隨著納米技術的深入研究，本團隊將注意力轉向納米材料學，以此來闡述炭藥炮制后物質基礎的變化，并在前期研究中已經證實納米類成分為炭藥發揮藥效的物質基礎[34]。除傳統認為的“炒炭止血”的經典活性之外，炭藥還具有鎮靜[35]、降糖[36]、鎮痛[29]、抗寒[37]等生物活性。進一步的研究顯示，不同基源獲取的炭藥納米類成分、相同基源不同炮制條件獲取的炭藥納米類成分由于粒徑、化學基團等性質的差異，生物活性呈現多樣性的特點，如黃柏炭納米類成分具有止血[38]、改善銀屑病樣炎癥[39]的作用等。本實驗以天然產物射干作為前驅體，從中制備并分離出了BRC-NCs，并通過TEM法分析顯示，其粒徑分布在1～7nm之間，晶格間距為0.263 nm。紫外、熒光結果顯示BRC-NCs具有熒光現象，其熒光量子產率為1.62%。FT-IR、XPS等結果分析顯示BRC-NCs主要含有由C、N、O三種元素組成且表面含有豐富的官能團如羰基、羥基。這種結構使其具有良好的溶解性和生物活性。

CCl4誘導的肝損傷是一種非常經典的肝損傷模型，廣泛用于保肝藥物篩選[40]。CCl4引起急性肝損傷的機制主要是CCl4可通過激活肝微粒體細胞色素P450產生CCl3和CCl3O2自由基。這些自由基可以與肝細胞中的大分子共價結合，攻擊細胞質膜下的不飽和脂質，從而誘導脂質過氧化[41]。脂質過氧化及其降解產物會破壞肝細胞膜的完整性和穩定性，增加肝細胞膜的通透性，導致細胞質中ALT、AST等酶流入血液。因此，ALT、AST水平的高低是判定肝損傷程度的重要指標[42]。肝臟功能損傷反映為膽紅素代謝缺陷，例如肝細胞攝取減少、膽紅素結合受損和肝細胞膽紅素分泌減少。肝臟系統的結構或功能異?？蓪е履懠t素增加。因此，血清膽紅素是檢測肝臟代謝狀態最直接的指標[43]。本實驗中，模型組小鼠血清中ALT、AST、DBIL、IBIL活性明顯升高。不同濃度的BRC-NCs干預后，血清中ALT、AST、DBIL、IBIL活性明顯降低，表明BRC-NCs對CCL4誘導的急性肝損傷有保護作用。

自由基引發的促氧化劑和抗氧化劑之間的不平衡可導致氧化應激。有效抑制氧化應激可以控制肝損傷的進展[44]。MDA為脂質過氧化代謝的終產物，可損傷細胞，同時MDA不僅可以反映脂質過氧化的敏感性程度，還可以間接反映細胞損傷的程度[42]。SOD是細胞內主要的防御性抗氧化酶，可以清除自由基，減輕脂質過氧化的連鎖反應，保護細胞膜的結構穩定性和功能完整性[3]。研究[45]表明，射干生藥對DPPH、ABTS自由基有一定的清除能力，顯示出一定的抗氧化活性。本實驗結果表明，從射干炭中提取分離的BRC-NCs能有效緩解急性肝損傷小鼠肝組織中的炎癥細胞浸潤程度，降低肝細胞壞死、變性情況，其機制可能與降低MDA含量、升高SOD活性有關。BRC-NCs能夠通過提高抗氧化能力來減輕過度氧化應激對肝組織的損傷作用。但本實驗尚未從相關信號通路水平上去深入挖掘BRC-NCs的內在藥效機制，這是課題組今后努力的方向之一。同時，后期研究也應開展BRC-NCs的安全性研究工作，探討其在安全范圍內發揮最大的藥效劑量，以便更好地服務于臨床，為指導臨床合理用藥提供科學依據。

綜上，本研究利用高溫熱解法成功從射干炭中提取分離出新型納米類成分——BRC-NCs。在CCl4致急性肝損傷模型中，表面攜帶豐富活性基團的BRC-NCs表現出較好的保肝作用，其作用機制與降低血清ALT、AST、DBIL、IBIL含量有關。此外，BRC-NCs也可以在一定程度上增強機體的抗氧化能力。本實驗為BRC-NCs治療急性肝損傷的新型藥物研發奠定了實驗基礎和重要依據，也為中藥炭藥的物質基礎研究提供了一種全新的思維模式及科研方法。